Rev7相关蛋白复合物调节APC/C活性的结构基础

The regulation of cell cycle is the basis of the normal function of cells. APC/C is an important E3 ubiquitin ligase complex in cell cycle regulation, which is responsible for the poly-ubiquitination of Cyclin. APC/C alone does not have the activity until binds to the activator protein Cdh1 to identify substrates. Previous studies indicated that the human Rev7 protein inhibits the activity of APC/C by binding to Cdh1. In order to activate APC/C and promote cell cycle, Ran can compete with Rev7 and cause Cdh1 release. Interestingly, the Shigella effector protein IpaB also specifically targeted Rev7 leading to abnormal activation of APC/C. The molecular details of Rev7-related complexes are still not clear at present. In recent studies, we solved the crystal structure of Rev7-Ran complex, obtained crystals of Rev7-IpaB complex, and acquired a uniform and stable Rev7-Cdh1 protein sample. Based on these results, this project intends to study and compare crystal structures of Rev-Cdh1, Rev7-Ran and Rev7-IpaB complex, and reveal Rev7’s functions in cell cycle regulation by controlling APC/C activity.

细胞周期的有序进行是细胞发挥正常功能的基础。APC/C是细胞周期调控过程中重要的E3泛素连接酶复合体，负责催化细胞周期蛋白的多聚泛素化。单独的APC/C没有活性，需要结合激活子蛋白Cdh1而识别底物。研究发现人体Rev7蛋白通过结合Cdh1而抑制了APC/C的活性。为了激活APC/C并促进细胞周期的进行，细胞因子Ran可以竞争性结合Rev7而引起Cdh1的释放。有趣的是，痢疾杆菌效应因子IpaB也特异性靶向Rev7而异常激活APC/C。目前这些过程中Rev7相关复合物的分子细节还不清楚。在最近的工作中，我们解析了Rev7-Ran的晶体结构，摸索到了Rev7-IpaB的晶体，也获得了稳定均一的Rev7-Cdh1样品，以此为基础，本项目拟研究与比较Rev7-Cdh1，Rev7-Ran及Rev7-IpaB三个复合物的晶体结构，进一步揭示Rev7在细胞周期调控过程中影响APC/C活性的作用机制。

人体REV7蛋白仅含有211个氨基酸残基，但是在广泛的细胞通路中都起到重要作用，包括跨损伤DNA合成，细胞周期调控，非同源末端连接DNA修复等。本项目聚焦于理解REV7在细胞周期调控中发挥作用的分子机制，研究对象为3个重要REV7相关蛋白复合物：1）REV7-Cdh1复合物。Cdh1是有丝分裂后期促进复合体（APC/C）的底物结合亚基，REV7蛋白可以通过直接结合Cdh1而抑制APC/C的活性；2）REV7-RAN复合物。细胞因子RAN作为分子开关，在上游通路的调控下，可以竞争性结合REV7而引起Cdh1-APC/C的激活；3）REV7-IpaB复合物。IpaB是痢疾杆菌的一种效应蛋白，可以特异性靶向人体Rev7引起小肠上皮细胞的细胞周期停滞，而有利于痢疾杆菌的长期附着。在本项目的支持下，本研究组首先在体外鉴定了人体RAN蛋白与REV7蛋白相互作用元件，并首次解析了人体REV7-RAN蛋白复合物的2.0埃晶体结构，揭示了人体REV7与RAN相互作用的分子细节，通过生化实验证了人体REV7与RAN相互作用的关键氨基酸位点，并且发现人体RAN的开放构象与闭合构象具有不同的REV7结合能力，由此提出了在细胞周期调控过程中人体RAN调节REV7功能的模型。本研究组也首次解析了痢疾杆菌效应因子IpaB与人体REV7蛋白复合物的2.3埃晶体结构，揭示了人体REV7与痢疾杆菌效应因子IapB相互作用的分子细节，通过结构的分析与比对，鉴定与定义了REV7的适配器（adaptor）区域，可以适应不同配体的蛋白序列而发生构象变化。本项目研究成果使人们从分子水平更深入更全面的了解REV7相关蛋白复合物参与细胞周期调控的分子机制，以及痢疾杆菌的致病机理。我们完成了REV7-Cdh1蛋白的重组表达与纯化实验，但是目前还未获得高衍射质量的单晶，后续研究中将致力于解决这个难点。此外，我们还解析DNA双链断裂修复中重要的REV7-SHLD3复合物的2.7埃晶体结构，保证了研究的延续性。