成骨细胞的线粒体特征与骨质疏松症中医证型的相关研究

成骨细胞是骨质疏松症发生的关键细胞。成骨细胞的退变，使成骨细胞-破骨细胞的平衡发生改变，最终导致骨质疏松症的发生。前期的研究表明，造成成骨细胞退变的关键因子是线粒体能量代谢的改变。因此，我们设想成骨细胞生物特征的改变会在骨质疏松症的中医证型中有所反映，而这种生物特征改变的本质在于线粒体DNA和蛋白质的改变。基于这种设想，本课题以成骨细胞内线粒体DNA和蛋白质为突破点，采用中医学、生物学、信息科学等多学科交叉，通过建立不同证型骨质疏松症患者的成骨细胞体外培养体系，利用基因组学和蛋白质组学技术，观察不同证型的成骨细胞内线粒体DNA和蛋白质的表达，探讨不同证型的骨质疏松症患者成骨细胞线粒体的生物学特征，以挖掘出与某一证型相关的共性特征标志物，同时建立一种可视化的诊断模式，为骨质疏松症中医证型的实质和病情分级的研究提供合理的客观量化依据。

中医的辨证施治是长期临床实践的经验总结，其理论的科学性一直缺乏有力的直接证据加以证实。因此，研究中医“证”的本质，探索辨别骨质疏松症中医证型的方法，对防治骨质疏松症有重要意义。①本研究前期通过对去势大鼠线粒体相关蛋白及基因的变化及中药复方和中药单体对其调控的研究，初步认为提示补肾健脾中药复方在一定程度上抑制细胞的凋亡，中药单体补骨脂素可以上调成骨细胞内Bcl-2家族蛋白的表达。②收集原发性骨质疏松症的患者，进行辨证分型和分组。分别建立各个证型的成骨细胞和骨髓间充质干细胞体外培养体系，进行了Western Blotting分析，结果显示两组细胞中的肝肾阴虚型与正常组比较，Bcl-2表达上调，Bax表达下调，其余蛋白表达不明显，脾肾阳虚型与正常组比较，caspase3和Bid表达上调，caspase8表达下调，气滞血瘀型与正常组比较，Bcl-2表达上调。③在不同证型骨质疏松症患者线粒体相关基因的表达分析中，进行了Realtime PCR的分析，结果认为肝肾阴虚型与正常组比较，TFAM表达上调，TFB1M表达不明显，TFB2M表达下调；脾肾阳虚型与正常组比较，TFAM表达上调，TFB1M和TFB2M表达下调；气滞血瘀型与正常组比较，TFAM表达上调，TFB1M和TFB2M表达不明显。④在采用人全基因组表达谱芯片检测正常组、肝肾阴虚型、脾肾阳型和气滞血瘀型的基因表达谱。其差异基因分别为159、87、194和67条。各组比较后筛选共同的差异表达基因为34条，对这34条差异表达基因中进行Pathway分析，发现其中THC26703111、WBP5、PROK2、LCN这4条基因被注释到5条信号通路，包括氮代谢；丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢；谷胱甘肽代谢；JAK-STAT信号转导通路。蛋白质组学分析时发现TNFa、VDR、OPG、RANKL在各组中的表达明显。但数月后再对同一患者进行检测时发现，上述蛋白的表达情况与早前检测的结果不一致，但也发现外周血中线粒体DNA缺失率、线粒体DNA拷贝数、氧化损伤程度与原发性骨质疏松症的中医证型无关，但对原发性骨质疏松症有一定的预测价值。.综上所述，本研究初步在分子生物学水平上揭示骨质疏松症中医证型本质的部分机理，在一定的程度上为骨质疏松症中医证型的实质和病情分级的研究提供合理的客观量化依据，并搜寻到骨质疏松症中医证型密切相关的基因。