刺糖多孢菌GBL受体蛋白SsbR的调控功能研究

Quorum Sensing (QS) is the communication system between bacterial cells, γ-Butyrolactone (GBL) serves as the important signaling molecular in G+ bacteria. GBLs receptors considered as transcriptional repressors could lead regulatory cascade, through which activate multiple physiological functions including antibiotic synthesis. Saccharopolyspora actinomycete, Saccharopolyspora spinosa is the producer of the insecticidal compound, spinosad, which showed significant application value. Bioinformatical analysis reveals that this bacteria possesses homolog of GBL receptor studied in Streptomyces, as well as the homologs of potential targets, furthermore, the fermentation liquid of S. spinosa demonstrated the activity of GBLs molecules that it stimulated spinosad biosynthesis. In this project, the spinosad over-producing strain ASAGF73, screened from previous work in our research group, will be used to deeply study the regulation mechanism of.GBL receptor SsbR in regulatory cascade, which contributes to reveal the regulatory role of SsbR in morphological differentiation, secondary metabolism and other important physiological metabolisms of S. spinosa, this work allows to enrich the regulation mechanism in QS system of G+ bacteria. Meantime, this work provides also more experimental data and theoretical basis in the study of spinosad biosynthesis regulation network.

群感效应（Quorum Sensing，QS）是细菌的细胞间通讯系统，γ-丁酸内酯（Gamma-Butyrolactone，GBL）是G+细菌中重要QS信号分子。GBLs受体作为转录抑制蛋白可介导级联调控，从而激活包括抗生素的合成等多种生理功能。糖多孢菌属放线菌刺糖多孢菌，是具有重要应用价值的杀虫化合物多杀菌素的生产菌。通过生物信息学分析，刺糖多孢菌具有与已知的链霉菌GBL受体同源蛋白SsbR及其潜在的靶调控因子，此外，刺糖多孢菌发酵液具有类似GBLs分子活性，可增强多杀菌素合成。本项目以研究组前期选育到的多杀菌素高产菌ASAGF73为出发菌株，对GBL受体SsbR在级联调控系统的调控机理做深入研究，有助于揭示SsbR在刺糖多孢菌的形态分化、次级代谢和其它重要生理代谢中的调控作用，丰富G+细菌QS系统的调控机制。同时，也为研究多杀菌素的生物合成调控网络积累更多的实验数据及理论依据。

群感效应是微生物通过级联网络调控自身次级代谢和/或形态分化的一种调控机制，而刺糖多孢菌中的群感效应研究未见报道。γ-丁酸内酯（GBL）是G+菌中重要的群感效应因子。GBLs受体作为转录抑制蛋白可介导级联调控多种生理功能。SsbR蛋白是刺糖多孢菌基因组中唯一的GBL受体同源蛋白，其N端存在TetR家族高度保守的HTH DNA结合域。EMSA实验发现SsbR可以和sstA1、sstA2、sstA3的上游序列结合，进而调控SstA1、SstA2、SstA3的表达。研究发现，在发酵过程中，菌株ssbR和sstA的表达水平变化趋势相反，和链霉菌A因子级联调控模型中sstA被SsbR阻遏调控相符，推测SsbR对SstA的表达具有调控作用。进一步研究了SstA的下游调控基因，发现刺糖多孢菌中griR、sprA和ssgA的表达水平变化趋势和sstA一致，说明这三个基因可能受SstA的激活调控；而orf1、strR、sigA、σ-adsA、amfR的表达水平变化趋势和sstA不一致，可能这5个蛋白在发酵过程下不受SstA直接的激活调控。研究了GBL结构类似物1,4-丁内酯及天蓝色链霉菌M145发酵液提取物对刺糖多孢菌发酵的影响，发现高浓度的1,4-丁内酯，多杀菌素产量、生物量不断降低；而添加天蓝色链霉菌发酵液提取物对刺糖多孢菌的发酵影响不大，这说明天蓝色链霉菌M145发酵液的水复溶物对刺糖多孢菌没有诱导作用。可能因为不同放线菌产生的GBL信号分子虽然结构类似，但GBL信号分子有严格的构效关系，结构上的微小改变会导致诱导效果的显著降低；同时也表现出非常严格的种属特异性，一般情况下，某种放线菌是感应不到其他放线菌的群感效应信号分子。此外，通过转录组分析，构建了刺糖多孢菌中初级代谢与多杀菌素合成途径之间的关系模型。以上结果为刺糖多孢菌的全局性改造提供理论依据和新方向。