基于微环境调控的产多杀菌素刺糖多孢菌代谢机制研究

This application is about to establish a minor metabolic network including spinosad synthesis based on the genome annotation information of Saccharopolyspora Spinosa. By overexpressing some genes related to spinosad synthesis pathway including: gtt, gdh, gtt, gdh and loading module-SpnA, gtt, gdh and SpnN-SpnS, we will get a series of engineered S. Spinosa with different levels of spinosad, cellular oxidoreduction potential(ORP), and cellular CoA. Based on the metabolic flux calculation of the minor metabolic network under different extracellular ORP conditions, this study is going to analyze the expression levels and metabolite levels of some key genes by combining RT-PCR and metabolomics technology. Then a relationship model about the yield of spinosad, extracellular and cellular ORP, cellular CoA, metabolic flux, and the expression levels and metabolite levels of some key genes will be established. Based on this relationship model, this study will illuminate the regulatory mechanism of how cellular cofactor regulates spinosad synthesis. Finally, a quantitative relationship model could be established. Based on this quantitative relationship model, a genetically rational S. Spinosa will be constructed. Using this rational S. Spinosa, we will optimize the fermentation process and get a genetically engineered S. Spinosa and fermentation technology which we have the independent intellectual property rights.

本申请根据刺糖多孢菌基因组注释信息，建立包含多杀菌素合成途径和中心碳代谢途径的局部代谢网络；过表达多杀菌素合成途径部分基因，包括：gtt、gdh基因，gtt、gdh基因和起始组件（Loading module）SpnA基因，gtt、gdh和SpnN-SpnS基因，得到一系列具有不同多杀菌素产量、胞内外氧化还原环境（ORP）和胞内辅酶A（CoA）水平的工程菌；利用网络模型分别计算各株菌在不同胞外ORP下的通量分布，结合RT-PCR技术和代谢组学技术分析网络中特定基因的表达水平及代谢物水平，综合实验数据，探究不同菌株之间多杀菌素产量、胞内外ORP、CoA水平、代谢通量分布和特定基因表达水平及代谢物水平之间的相互关系，阐明胞内辅因子水平与多杀菌素合成的调控机制，最终建立定量关系模型。在此基础上，理性设计基因工程菌，开展发酵技术优化研究。获得具有我国自主知识产权的高产多杀菌素基因工程菌及发酵技术。

根据刺糖多孢菌基因组注释信息，建立了包含多杀菌素合成途径和中心碳代谢途径的局部代谢网络；利用FBA算法，模拟计算了添加NADH及NADPH对刺糖多孢菌多杀菌素合成及菌体生长的影响，并分析了不同转氢酶条件下刺糖多孢菌胞内通量分布；利用鲁棒性分析方法，研究了转氢酶活性对多杀菌素合成速率的影响，确定转氢酶基因改造靶点,并构建基因工程菌，工程菌发酵显示多杀菌素产量较原始菌提高了86.5%, 验证了模型预测的准确性；通过过表达多杀菌素次级合成途径关键限速基因，spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS，spnK，gtt，gdh 和kre，使多杀菌素的产量达到405mg/L，较原始菌产量提高了近五倍；采用代谢组学的研究平台，以野生刺糖多孢菌WT作为对照，对诱变和代谢工程改造得到的两株高产菌WH124和LU104进行了代谢物组层面的对比和分析。对检测的数据进行主成分分析和聚类分析结果表明，WH124在发酵初期大量的代谢中间物，如中心碳代谢中间体，氨基酸等初级中间代谢物的水平较高，WT次之，而在LU104中这些化合物水平最低。这反映出WH124和LU104在提高多杀菌素合成方面的机制是不同的；通过外源脂肪酸添加、改变胞外氧化还原电势（ORP）策略改变刺糖多孢菌发酵微环境，从相关基因表达水平、酶活水平及关键胞内代谢物浓度水平研究了微环境对多杀菌素合成的调控代谢机制：外源脂肪酸添加实验表明，多杀菌素合成途径基因转录上调，乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A的浓度增加，是导致多杀菌素产量的提高的主要原因；高的胞外氧化电势，改变了胞内NADH/NAD+水平，进而影响了其感受基因rex的表达，rex基因的表达水平影响了中心碳代谢途径、电子传递系统以及其他与之相关的代谢物水平，进而综合影响了多杀菌素的合成水平。以上研究，对未来开展多杀菌素高效合成菌株理性构建具有重要意义。