多杀菌素生物合成基因簇在不同链霉菌宿主中的高效表达及优化

Spinosad is a kind of broad-spectrum, low-toxic, low-residuel pesticide, produced by Saccharopolyspora spinosa via aerobic fermentation. Spinosad has became the sole microbial pesticide authorized to use in grain storage. But the fermentation level of spinosad production needs to be improved in China, mostly due to some factors such like slow growth, complexe metabolic pathway, difficulty in cultivating and low frequency in genetic transformation. The spinosyn biosynthetic gene cluster (spn cluster) is sequenced and reported, our research team has constructed genome library of S. spinosa in previous work and we have successfully isolated clones comprising spinosyn synthetic cluster. In this study, we would like to make spn cluster expressed heterologously using Streptomyces avermitilis, S. coelicolor, S. lividans and S. venezuelae as host strains because of their clear genetic background and mature fermentation process. But gene expression would be attenuated in the case of heterologous expression, thus, we need to analyze the transcripts of spn cluster and their expressions within multiple Streptomyces strains. The method is to change the weak promoter region of spn cluster to a strong one in order to enhance the expression of transcripts in heterologous hosts, then to increase the production of spinosad. The common host-vector system of long synthesis cluster expressed in Streptomyces will be established through this work, which will provide the platform for studying biosynthesis and regulation of secondary metabolites of the strains difficult to be cultivated, moreover, this work will also provide theoretic and practical evidence in constructing high yield antibiotic-producing strain using genetic engeering method.

多杀菌素是由刺糖多孢菌发酵产生的广谱、低毒、低残留的杀虫抗生素，由于兼具生物农药的安全性和化学农药的速效性，成为唯一批准可以应用于粮食储藏的微生物源杀虫剂。然而目前国内多杀菌素发酵产量较低，主要是由于刺糖多孢菌存在生长缓慢、代谢途径复杂、培养调控困难和遗传转化效率低等一系列问题。异源表达可能是解决这些难题的有效途径，本研究在现有工作基础上，以遗传背景清晰、发酵工艺成熟的阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌及委内瑞拉链霉菌作为宿主菌，异源表达多杀菌素生物合成基因簇；并对基因簇内转录子及各转录子在不同宿主中的表达进行深入分析，有望通过更换强启动子来提高相关基因的表达，进而提高多杀菌素的产量。通过本研究将建立大片段合成基因簇在链霉菌中异源表达的通用宿主-载体系统，为一些难培养菌株的次级代谢产物生物合成与调控研究提供平台，并为利用基因工程手段构建抗生素高产菌株奠定理论与实践基础。

我国多杀菌素的发酵水平与国外相比差距较大，主要是由于刺糖多孢菌存在生长缓慢、代谢途径复杂、利用长效碳源的能力较差、培养调控困难和遗传转化效率低等一系列问题，而且多杀菌素合成的调控基因目前仍不清楚。本研究通过在链霉菌中表达多杀菌素生物合成基因簇，希望在遗传操作、培养条件更容易的宿主中获得多杀菌素高产菌株。本项目实施期内，成功将多杀菌素生物合成基因簇导入到不同链霉菌中，并在天蓝色链霉菌、变铅青链霉菌中获得可产多杀菌素的转化子，但产量较低。同时，我们发现鼠李糖合成基因对多杀菌素的异源表达极为关键，但即使对这些基因进行表达增强，也并不能有效提高多杀菌素在链霉菌中的产量。利用敲除了4个化合物生物合成基因簇的天蓝色链霉菌突变株作为宿主，也没有明显有助于多杀菌素产量提高。通过RT-PCR检测分析，我们发现多杀菌素合成基因簇表达量较微弱，这可能是限制多杀菌素母环结构合成的主要因素。因此在接下来的工作中，我们将对多杀菌素生物合成基因簇内编码PKS的基因进行启动子强化，希望通过促进母环合成使多杀菌素产量提高。由于刺糖多孢菌碳代谢机制并不明了，我们对该菌的葡萄糖及麦芽糖代谢进行了初步研究，发现该菌在发酵初期可能存在碳阻遏效应，如何消除该阻遏，将有效提高菌体对碳源的利用，促进生物量及多杀菌素产量。刺糖多孢菌调控机制尚无报导，本研究发现刺糖多孢菌中存在全局调控因子，目前该部分研究已有初步进展，相关研究内容已获得2017年国家自然科学基金资助。