粗糙脉孢菌纤维二糖转运蛋白的分子功能及调控机理研究

纤维二糖（cellobiose）转运的分子机理远不清楚，特别是该糖特异转运蛋白(transporter)的研究，知之甚少。本实验室在先前的合作研究中从粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)克隆了纤维二糖转运蛋白基因CDT1、CDT2（Science. 2010. 334: 84-86），并作了初步分析，但这些转运蛋白自身的分子功能及其表达调控尚待研究。本课题利用遗传学模式真菌-粗糙脉孢菌，通过构建CDT1，CDT2基因双敲除菌株，系列点突变体和基因回补菌株，研究CDT1、CDT2的分子功能和互作关系；通过研究CDT1、CDT2基因表达调控，分析调控基因的调控网络，来阐释纤维二糖转运蛋白基因表达调控及整个纤维二糖转运途径的分子机理。由于该转运蛋白基因2010年刚刚克隆发表，深入研究其分子功能和表达调控有很好的创新性和必要性，对纤维二糖代谢这一基础科学问题的机理阐释同样有着重要意义。

寡糖转运和代谢是生命科学的基本基础问题。CDT1和CDT2是近年来从粗糙脉孢菌中发现的纤维寡糖转运蛋白，尽管CDT-1在工程酵母中显示在纤维素乙醇生产中的巨大潜在应用，但CDT-2却效果不好。与酵母中结果相反，CDT-2在粗糙脉孢菌中却更为重要，在纤维素作为碳源条件下，敲除CDT-2比敲除CDT-1表现出更加强烈的生长缺陷表型。因此暗示，CDT-2在粗糙脉孢菌纤维素降解中有更多功能有待挖掘。通过我们的研究发现，CDT-2不仅在纤维素条件下生长有缺陷，在半纤维素为碳源条件下，生长缺陷更加严重。转录组分析表明，CDT-2作为一个寡糖转运蛋白，不仅在纤维素降解中有作用，而且在半纤维讲解中也有重要作用。多数纤维素酶和半纤维素酶基因在cdt-2突变体中显著下调表达。而人工过表达CDT-2基因，则可以提高纤维素酶和半纤维素酶的表达。我们在粗糙脉孢菌和酿酒酵母系统测试了CDT-2木寡糖转运能力，研究表明，CDT-2不仅是纤维素寡糖转运蛋白，而且是木寡糖转运蛋白，通过影响纤维寡糖和木寡糖的转运而影响纤维素和半纤维素的降解。而且通过研究纤维寡糖转运蛋白调控，我们发现CDT-2主要受xlnR调控，而CDT-1主要受CLR-1转录。. 另外，我们发现了纤维寡糖转运途径中一个新的蛋白，CLP1 (NCU05853)，他是纤维寡糖转运蛋白同源蛋白，同时也是纤维寡糖诱导纤维素酶表达途径的一个关键新元件。尽管CLP1 不具备纤维寡糖转运能力，却可以在纤维素和纤维二糖条件下抑制纤维素酶的诱导表达。通过构件多突变体，在主要葡萄糖苷酶缺失背景下，继续敲除纤维寡糖转运蛋白cdt-2 和clp-1基因,获得5突变体CPL7。在纤维二糖条件下，和葡萄糖苷酶3敲除菌株相比，CPL7纤维素酶分泌水平提高6.9倍。研究表明，CLP1主要通过抑制纤维寡糖的转运蛋白表达，特别是cdt-1表达，来抑制纤维素酶的合成。进一步转录组分析表明，在组合敲除突变体CPL7中，纤维素酶基因及其主要的调控基因都显著上调表达。. 本研究不仅大大加深了我们对寡糖转运途径的功能理解，同时对进一步通过代谢工程，在丝状真菌和酿酒酵母中改造利用寡糖转运途径，实现寡糖在生物炼制中的应用有促进作用。