miRNA-144及miRNA-145通过表观调控RANKL/OPG系统参与正畸牙移动的研究

The basis of orthodontic tooth movement involves periodontal tissue remodeling under mechanical force, the core of which is alveolar bone remodeling. Two processes, bone resorption in compression side and bone formation in the tension side of the alveolar bone, constitute the basic pattern of bone remodeling during tooth movement. As one of the key pathway, the RANKL/RANK/OPG pathway has been the focus of bone remodeling study. The present proposal aims to explore the mechanism that mir-144 and mir-145 regulate RANKL/RANK/OPG pathway epigenetically by firstly analyzing the expression profile of miRNAs during osteoblastic differentiation, especially mir-144 and mir-145, followed by studying the function of mir-144 and mir-145 through observing key indexes representing bone remodeling in a osteoblasts-osteoclasts co-culture system during gain-of-function study and loss-of-function study with the aid of lentivirus-mediated gene transferring and finally verifying the direct targeting relationship between mir-144/mir-145 and RANKL/ OPG with dual lusiferase assay. the present proposal also plans to test the involvement of miRNAs during orthodontic tooth movement in situ by ISH. This proposal hopes to bring up brand new epigenetic dimension in regulation of orthodontic tooth movement and foundations for new possibility of accelerated tooth movement during daily practice.

牙槽骨的改建是正畸牙移动过程的重要环节，包括了压力侧的骨吸收与张力侧的骨形成两个过程。保持成骨与破骨的协调是正畸牙移动的关键。RANKL/OPG系统是成骨细胞与破骨细胞联络配合的重要通路，也是近十年来骨改建研究的焦点之一。本研究拟以RANKL /OPG通路的小分子RNA表观调控为研究对象，首先分析成骨细胞分化过程中小分子RNA表达谱的变迁；然后通过慢病毒转染构建稳定表达及抑制表达mir-144或mir-145成骨细胞株并观察其与破骨细胞共培养模型中成骨与破骨过程相关指标以研究mir-144及mir-145通过干预RANKL/ OPG系统调节成骨与破骨速率的机理；同时利用双荧光素酶报告确证mir-144与mir-145对RANKL/OPG的直接靶点并通过原位杂交研究其在正畸牙移动中的表达现象，为研究正畸牙移动中骨改建的调控提供新的表观遗传学思路，为临床上开发加速牙移动的手段提供新的理论基础。

骨由骨髓间充质干细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、细胞外基质、矿物质等构成。正常生理状态下，各种细胞各司其职，将骨代谢维持在一个平衡状态，其中成骨细胞与破骨细胞最为关键。如果这种平衡打破，就会引发各种骨代谢疾病，例如骨质疏松、骨关节炎等疾病。因此，研究成骨细胞和破骨细胞的增殖和分化对于治疗骨代谢疾病和研发新的治疗药物有重要作用。.MicroRNA （miRNA）是一类保守的内源性非编码小分子RNA，长度仅为20~25个核苷酸。在生物体内，miRNA可以特异性地与靶基因mRNA的 3’端非翻译区 (3’Untranslated Region, 3’UTR)的保守结合序列互补性结合，从而加速mRNA降解或抑制其翻译过程，以达到转录后调控基因表达的功能。已经有研究表明miRNA可以通过调节一些细胞因子、转录因子和信号媒介的表达来调节骨代谢，包括骨形成、吸收、改建、修复、和骨相关疾病等。在骨代谢过程中，miRNA通过影响破骨细胞活性调节骨吸收，也调节成骨细胞的增殖和分化。因此，理解骨调节相关miRNA在骨代谢中的作用以及细胞分子生物学机制对于发展更好的临床治疗路径有很重要的作用。.RANKL/OPG系统是成骨破骨平衡的重要调节工具之一。本研究计划通过研究Mir-144/145对RANKL/OPG的影响，来阐述Mir-144/145对成骨过程的调节作用。.结果：Mir-144/145在成骨细胞系中表达量小且不稳定，对成骨细胞分化不起决定性意义。.哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞生长、代谢和凋亡等过程，并且与肿瘤的发生与发展有密切联系。靶向mTOR并且干扰mTOR/STAT3信号通路已经被证实是有效的抗肿瘤策略。本研究探索了microRNA在成骨细胞分化和肿瘤形成中的作用。.结果：腺样囊性癌细胞转染microRNA-144-3p后，细胞活性下降、凋亡比例升高。双荧光素酶实验证明mTOR是microRNA-144-3p的直接靶点。蛋白印迹实验，免疫荧光实验和体外成瘤实验证明miR-144-3p通过靶向mTOR降低mTOR及其下游的表达.因此，提高miR-144-3p的表达有可能作为治疗腺样囊性癌细胞的潜在药理之一