P选择素标记靶向超声微泡增效miRNA-21、126及140共表达腺相关病毒修饰的BMSCs移植修复早期激素性股骨头坏死

Steroid-induced avascular necrosis of the femoral head (SANFH) is the most common and frequently-occurring disease in the field of orthopedics. However, there is rare effective early treatment approach to cure this disease. On the basis of preliminary studies, we intend to construct recombinant adeno-associated virus (rAAV) co-expression of microRNA-21, microRNA-126 and microRNA-140 which have the role of anti-apoptosis, angiogenesis and promoting osteogenic differentiation using the unique genetic modification effect of microRNA and polynucleotide coexpression technology. After core decompression surgery on SANFH model, P-selectin monoclonal antibody marked targeted microbubbles is targeted blasting in bone defect area using ultrasound-targeted microbubble destruction technique. Then, BMSCs modified by rAAV will transplant into bone defect area using EX-VIVO technique. Repair effects of rAAV vector on early SANFH in rabbits are evaluated by observing AAV mediated exogenous nucleotides, the target gene expression, apoptosis as well as imaging findings and pathological histology changes from animal models. Our studies may provide a solid experimental basis and theoretical preparation for early treatment of SANFH.

激素性股骨头坏死（SANFH）是骨科领域的常见病、多发病。目前缺乏有效的早期治疗方法。本课题拟在前期研究的基础上，以提高转基因效率及靶向治疗为切入点，利用microRNA独特的表观遗传修饰效果，应用多核苷酸共表达技术，构建具有抗细胞凋亡、促血管新生及促成骨分化作用的miRNA-21、miRNA-126及miRNA- 140共表达重组腺相关病毒（rAAV）。在SANFH模型髓芯减压术后，利用超声微泡靶向破裂技术靶向增效细胞移植的特点，在SANFH髓芯减压骨缺损区内靶向爆破P-选择素单克隆抗体修饰的靶向微泡，继而应用EX-VIVO技术在髓芯减压骨缺损区内移植入经rAAV表观遗传修饰的BMSCs，通过观察rAAV介导外源核苷酸的能力、目的基因的表达情况、细胞凋亡情况以及动物模型的影像学表现与病理组织学变化等，评价其对SANFH的修复作用，为SANFH早期治疗提供坚实的实验基础和理论准备。

激素性股骨头坏死（SANFH）是骨科领域的常见病、多发病，目前缺乏有效的早期治疗方法。本课题应用多核苷酸共表达技术，构建具有抗细胞凋亡、促血管新生及成骨分化作用的miRNA-21、miRNA-126 及miRNA- 140 共表达重组腺相关病毒（rAAV），在SANFH 模型髓芯减压术后，利用超声微泡靶向破裂技术靶向增效细胞移植的特点，在SANFH 髓芯减压骨缺损区内靶向爆破P-选择素单克隆抗体修饰的靶向微泡，继而应用EX-VIVO 技术在髓芯减压骨缺损区内移植入经rAAV 表观遗传修饰的BMSCs。结果表明： 1.AAV helper-free system包装效率可达95.28±0.12%；纯化病毒感染滴度达5.6×1011vp/mL。2. 应用全骨髓密度梯度离心法联合贴壁筛选法可获得较高纯度的兔BMSCs；重组AAV感染BMSCs的最佳感染复数为105vg/cell；在最佳感染复数下， BMSCs细胞增殖无显著变化。3.随着感染时间的延长，7 d为重组AAV体外介导基因表达的峰值时间。4. 重组AAV感染BMSCs后体外诱导 HUVEC细胞形成血管管腔样结构；体外诱导 BMSCs细胞成骨分化，ALP Gomori钙钴法染色阳性。5.重组AAV修饰BMSCs体内移植能增加CD34阳性血管数，产生明显的新生血管侧枝循环；产生明显的原位成骨及钙盐沉积。综上说明：rAAV在体内外具有优良的介导基因表达的时效性和优良的抗凋亡、血管生成及骨生成生物学活性；在SANFH髓芯减压骨缺损区内利用UTMD技术增效rAAV修饰的BMSCs移植，其通过增加股骨头组织的血运、增强股骨头区骨组织质量提高激素性股骨头坏死区骨修复能力，对兔早期SANFH具有良好的修复效果。本课题的实施为SANFH 早期治疗提供坚实的实验基础和理论准备。