Tim-3在HBV感染所致CD8+T细胞功能失调中的作用及机制研究

HBV感染导致的细胞免疫功能紊乱，尤其是CD8+T细胞功能失调是乙型肝炎发生发展的重要原因，深入探讨其机制，必将为预防和治疗乙肝提供新的切入点。Tim-3是近期发现的新型免疫抑制分子，参与多种免疫性疾病发生。我们的前期研究证明，慢乙肝患者和小鼠乙肝模型中CD8+T细胞Tim-3表达显著升高，且Tim-3表达与患者ALT水平正相关，沉默Tim-3可上调CD8+T细胞 IFN-γ表达，而HBV转基因鼠和HBV转染细胞中均可检测到Tim-3表达的上调。据此，我们提出假设：HBV感染通过调节Tim-3表达，影响CD8+T细胞功能，进而参与乙肝发生。本研究拟从临床标本、体外细胞模型和动物实验，利用基因转染、抗体阻断和siRNA等多种方法研究Tim-3对CD8+T细胞功能影响及其在乙肝发生中的作用。本研究的实施与完成，将为揭示HBV感染性疾病发生机制提供新的思路，同时也为探索新型治疗方案提供依据。

流式细胞术检测慢乙肝患者外周PBMC不同淋巴细胞中Tim-3表达，结果显示，慢乙肝患者外周CD8T及NK细胞中Tim-3表达显著高于健康对照，且CD8T中Tim-3表达与HBV滴度明显相关，提示HBV可以调控Tim-3表达。为验证HBV对Tim-3的表达调控作用，首先分离慢乙肝患者PBMC，抽提其DNA及RNA，分别检测HBVDNA及Tim-3mRNA，结果与上述流式结果相似，HBVDNA阳性PBMC中Tim-3mRNA显著高于HBVDNA阴性PBMC，提示，HBV对Tim-3的转录具有直接调节作用。肝癌细胞转染实验结果证实，HBV及其编码蛋白可以上调Tim-3转录及表达，Tim-3启动子报告质粒分析证实HBV及其编码蛋白可以促进Tim-3启动子活性。为研究高表达的Tim-3对CD8T细胞功能的调节作用，利用流式细胞术对CD8T进行表型分析，结果发现，Tim-3+CD8T细胞表现为耗竭状态（细胞活化，但功能抑制）。阻断Tim-3不仅能够抑制HBs抗原介导的CD8T应答，并且促进CD8T的活化诱导凋亡，进一步提示Tim-3高表达介导慢乙肝患者CD8T耗竭。体内抑制试验支持上述结果。NK剔除实验发现，Tim-3抑制CD8T应答依赖于NK细胞的存在，Tim-3同样参与调节NK细胞应答。综上所述，本研究首次证明HBV感染介导Tim-3表达升高，进而抑制HBV特异性CD8T细胞及NK细胞应答，可能是慢乙肝患者免疫耗竭的重要机制；研究结果强烈提示Tim-3是阻断HBV慢性感染的非常有意义的潜在靶点。上述结果以第一作者及通讯作者发表标注SCI论文7篇。