水牛孤雌激活胚胎蛋白质组学研究和功能验证

Oocyte act as the genetic vector for zygote reprogramming, the maternal substance play a key role in preimplantation embryo development. In this study, Parthenogenetic activation embryo and MII oocyte of buffalo will be analyzed by proteomics methods and quantitative analysis of differential expressed proteins, The phosphorylation modification sites of parthenoactivation embryo will screened also, the important maternal proteins will be identifed in functional verification. This project involve four issues as follow, 1) LC-MS and Multi-dimensional Protein Identification Technology(MudPIT) was employed to construct the proteome profiling of Parthenoactivation cleavage (PC) and Metaphase II (MII) oocyte, and make the basis for maternal proteins discovery. 2) comparing the two stages (PC stage and MII stage when the maternal express highly) using TMT labelling technology, screening the maternal proteins (factors) candidates with important biology function. 3) enrich the phosphorylation peptide with IMAC method and analyis phosphorylation sites with LTQ-Orbitrap Mass spectrometer. 4) Verify the important candidate proteins with Realtime-PCR and Western blot and analyze the cell location with fluoroimmunoassay，preliminary interpretate the biological function of differential proteins. In short, by the way of a large scale of proteomics research and function verification, exploring the regulate rule of maternal protein in preimplantation embryo development, which has important significance of understanding biological pathway of mammalian preimplantation embryo development.

卵母细胞是合子基因组重编程的载体，其中的母源性物质是启动早期胚胎发育的关键物。本项目开展水牛MII期卵母细胞和孤雌胚胎的蛋白质组分析，定量分析差异蛋白质，寻找孤雌胚胎磷酸化修饰位点，筛选和验证重要母源性蛋白质的功能。包括：1）利用二维液相-质谱技术建立孤雌胚胎和MII期卵母细胞的蛋白质表达谱，为发现母源因子提供基础数据；2）利用外标定量技术，比较母源性蛋白质表达最强的孤雌卵裂胚与成熟卵母细胞的蛋白质表达差异，得到一批母源因子候选物信息；3）IMAC富集磷酸化肽，质谱分析和鉴定磷酸化位点，生物信息学分析以上表达量/修饰差异的蛋白质；4）RT-PCR、Western blot验证重要母源蛋白质在转录水平和翻译水平表达，细胞荧光免疫法分析蛋白质定位信息，初步解释其生物学功能。以上研究致力于发现早期胚胎中母源蛋白质的表达变化并验证功能，有助于深入认识哺乳动物早期胚胎发育的生物学调控途径。

所有动物的卵子在发生过程中都积累了一定量的mRNA和蛋白质。这些母源基因产物调节卵母细胞发育的各个方面，包括受精，减数分裂和有丝分裂细胞周期之间的转换，以及其合子基因组的激活等。哺乳动物孤雌生殖是生殖生物学中一个重要的研究课题和研究模型，因为它不需要任何父源因子的参与，这使其成为研究母源基因组的理想模型。本研究以亚热带重要的经济牲畜水牛作为研究对象，使用定量蛋白质组学方法结合孤雌激活前后的水牛卵母细胞/孤雌胚胎的转录图谱的综合分析，发现卵子被激活后，由母源基因组调控表达的蛋白质可能首先参与细胞连接的形成。 此外，研究发现了先前在模式生物小鼠中报道的两种母源蛋白质（NPM2，NLRP5）。 此外，研究表明水牛的孤雌生殖可能存在与正常受精胚胎类似的“MZT”过程（母型调控向合子型调控转变），且这个过程可能发生在8细胞期至16细胞期之间。本研究为进一步研究和筛选母源效应基因或蛋白质提供了丰富的数据资源，提高了我们对水牛母源基因组学在附植前胚胎发育过程中的调控机制的认识，为进一步改善体细胞核移植和胚胎干细胞技术奠定了理论基础。同时，本研究的策略和方法也可为其他物种探索母源基因组的功能提供有价值的参考。