蒺藜苜蓿响应铝胁迫的差异蛋白质组学研究和抗性基因功能验证

Aluminum (Al) toxicity is major limiting factor of alfalfa (Medicago. sativa L.) production in acidic soils. Medicago truncatula Gaertn., a close relative of alfalfa , is the model of legume. Previous studies has initially revealed the aluminum resistance mechanism in Medicago truncatula from genome and transcriptome level, and a proteomics study will be used here to further explore the mechanisms of Al toxicity and resistance. In this work, 2-DE, iTRAQ and MS/MS will be used for isolated and identified Al-resistant and Al-sensitive lines of M.truncatula root and root plasma membrane proteins that response to Al stress. Gene Ontology, pathway, cluster analysis will be used for analysis the functions and pathways of differentially expressing proteins. All of that will help us to reveal generality and specificity metabolic pathways among various M.truncatula that involving in Al stress. Meanwhile, the function of potential key genes will be study using in silico cloning,Western blot, qRT-PCR, super-expression and RNAi. That will help us identify potential Al-tolerance key genes from M.truncatula. The completion of this project will help us a better understanding the molecular mechanism of aluminum resistance in M.truncatula , as well as creating conditions for using biotechnology improved alfalfa Aluminum resistance.

铝毒是影响紫花苜蓿在酸性土壤中生长的主要因素。紫花苜蓿近亲蒺藜苜蓿为豆科模式植物，国内外研究者已从基因组和转录组对其抗铝毒分子机理进行了研究，本研究拟从蛋白质组对其抗铝毒机理进一步研究。研究拟选取不同铝敏型蒺藜苜蓿为材料，使用2-DE、 iTRAQ 标记和质谱鉴定技术对其根和根质膜在响应铝诱导不同时间点差异表达蛋白进行筛选和鉴定；运用GO 注释分类、pathway 分析、聚类分析等方法对差异蛋白的功能和参与的代谢途径进行分析，以期寻找不同铝敏型蒺藜苜蓿响应铝胁迫应答机制中存在的共性和特异性调节机制。同时从差异表达蛋白中筛选关键调节基因，并借助电子克隆技术、Western blot、qRT-PCR 技术、超表达和RNAi遗传转化检测等对其具体功能分析验证，发掘抗铝性关键基因。本项目的完成将有助于更深入的了解蒺藜苜蓿抗铝毒机制，为生物技术改良紫花苜蓿抗铝性创造条件。

实验选取PI1384662（抗铝型，T）和PI5776134（敏铝型，S）蒺藜苜蓿，5天龄幼苗以2.5μmolAlCl3胁迫6d。iTRAQ分析全株蛋白，双向电泳分析根蛋白。iTRAQ结合质谱从不同处理中成功鉴定出4156个蛋白质，在S组中鉴定出381个差异表达蛋白，在T组中鉴定出134个蛋白。2-DE结合质谱在S组鉴定25个，T组鉴定27个差异表达蛋白。GO聚类分析表明，S组和T组中差异表达蛋白具有相似的分布。KEGG富集分析表明，S组和T组中表达上升的蛋白富集在光合作用和核糖体代谢途径；而S组中表达下降的蛋白富集在含硫氨基酸、苯丙氨酸、络氨酸等氨基酸代谢和异黄酮代谢、生物碱等次级代谢途径；而T组则富集在苯丙氨酸和醇类次级代谢途径中。这表明，不同敏铝型蒺藜苜蓿的差异主要体现铝毒导致次级代谢差异。选取6个潜在的抗铝调节基因进行转录水平验证，筛选出ABA receptor PYR1-like protein (MTR_5g030500)转录水平和蛋白水平同步较好，作为候选基因。利用RT-PCR方法，扩增出该蛋白基因全长cDNA，获得一段938bp序列，包含一个完整开放阅读框651bp，编码217个氨基酸。该cDNA与Genbank中发表的序列（XM_003612867.2）完全相同，命名为MtPYR1。定量分析表明该基因受Al3+和ABA诱导。通过pBI121载体，将MtPYR1基因构建植物表达载体pBI-PYR，采用农杆菌介导的方法转化紫花苜蓿。利用pKANNIBAL和pART27载体，构建蒺藜苜蓿MtPYR1基因RNAi载体pART-F-R，通过叶片共培养法转化蒺藜苜蓿。结果表明，Al3+处理条件下，转基因苗根系的生长能力较野生型强。MtPYR1基因沉默表达的转基因植物不能正常的形成新芽分化。综上所述，本项目从蛋白组学水平解释了不同铝敏型蒺藜苜蓿相应铝胁迫的调节机制。建立了蒺藜苜蓿全蛋白库，发掘大量参与铝调节的蛋白，并对其中基因进行验证。本研究为深入挖掘苜蓿中抗铝毒基因奠定了基础。