基于定量磷酸化蛋白质组学在水牛精子发生过程的分子机制研究

Spermatogenesis is a remarkably sophisticated process and regulated by a variety of factors transcription, translation and post-translational modification. In mammals, spermatogenesis is classically divided into three major phases: spermatocytogenesis, meiosis, and spermiogenesis. In our previous studies, we had identified many phosphorylating enzymes in the buffalo testicular seminiferous tubules and the results indicated that phosphorylation was universal in buffalo spermatogenesis. In order to further study the regulation mechanism of protein phosphorylation in buffalo spermatogenesis, we will employ tandem mass tag (TMT) coupled to TiO2 phosphorylated peptides enrichment with quantitative phosphoproteomics technology to panoramically display the expression changes of proteins and phosphoproteins among the isolated and purified different stage of spermatogenic cells in buffalo. Functional verification of spermatogenesis –related important proteins and phosphorylation sites need to be further conducted. Taken together, this research will help to further elucidate the molecular regulation mechanism of spermatogenesis and lay a theoretical foundation for the in-depth study of male reproductive mechanism in buffalo, and also provide potential molecular targets of male infertility.

精子发生是一个复杂且涉及多种因子转录、翻译和翻译后修饰等调控的过程，包括精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂及精子形成三个阶段。在前期研究中，我们在水牛睾丸曲细精管中鉴定得到大量与磷酸化修饰相关的酶类，表明磷酸化在水牛精子发生过程中普遍存在。为了进一步研究蛋白磷酸化在水牛精子发生过程的调控机制，本项目将以与精子发生联系最密切的生精细胞作为研究对象，拟对不同阶段生精细胞进行分离纯化并鉴定，采用TMT标记技术结合二氧化钛（TiO2）磷酸化肽段富集的定量磷酸化蛋白质组学研究策略，全景式地展现不同阶段生精细胞蛋白及磷酸化蛋白表达的变化，找出与水牛精子发生相关的磷酸化蛋白及修饰位点，并对重要蛋白及位点进行相关的功能验证。该研究将有助于进一步阐明精子发生的磷酸化调控机制，为深入水牛雄性生殖机理的研究奠定理论基础，同时为研究雄性不育的机制提供潜在的分子靶标。

水牛是我国南方地区特色的家畜，具有耐粗饲、耐湿、耐热、抗病、乳制品营养价值高等特点。水牛种群的生产性能较低，亟待通过品种改良提高其经济价值，目前关于水牛的精子发生机制仍不清楚。蛋白质是生命活动的直接承担者，从蛋白质翻译和翻译后修饰层面研究精子发生将直接阐释其生理条件下的变化机制，为水牛雄性生殖生理的研究提供新的视角。.本文的主要研究结果如下：.一、水牛生精细胞、支持细胞蛋白质组和磷酸化蛋白质组表达谱的构建和分析。通过对质谱数据的分析，成功构建水牛生精细胞和支持细胞蛋白质表达图谱，获得了高丰度蛋白质信息。利用生物信息学分析工具富集到一批与精子发生相关的蛋白质和信号通路，发现剪接体相关蛋白质在精子发生过程中发挥重要作用。通过对磷酸化位点修饰的激酶分析，发现一批调控精子发生的蛋白激酶。.二、水牛不同类型生精细胞定量蛋白质组和定量磷酸化蛋白质组的分析。成功分离出精原细胞、精母细胞和精子细胞，并获得差异表达蛋白质219种，差异表达磷酸化蛋白质71种。对差异蛋白质和差异磷酸化蛋白质在精子发生过程中表达趋势分析，获得了蛋白质动态表达图谱，发现了在精子发生的不同时期主要生物学进程的调控。通过激酶底物磷酸化位点网络分析，发现AKT1激酶活力最高， LMNA受到最多激酶的调控，且AKT1催化 LMNA发生磷酸化修饰。进一步验证发现AKT1蛋白能显著调控LMNA的S392位点的磷酸化水平。.三、 性成熟前后水牛睾丸差异磷酸化蛋白质组分析。对性成熟前后水牛睾丸进行分析，获得差异蛋白质228种，差异磷酸化蛋白质104种并对应363个位点，其中有5个差异蛋白也发生了磷酸化位点的变化，且其蛋白和磷酸化位点变化趋势一致。Western blot实验证实ODF1、NUCKS1、LMNA（pS392）和PSMA3（pS250）蛋白在性成熟前后水牛睾丸中的表达变化与质谱定量结果一致。.综上所述，本研究探索了水牛睾丸的蛋白质组信息，获得了参与水牛精子发生、发育的蛋白质表达图谱及动态变化，为了解水牛精子发生发育的分子机制提供线索。