鱼体表粘液抗菌肽对海水养殖鱼类特定腐败菌和致病菌的作用机制

The metabolic activity of specific spoilage organisms is the main reason for the aquatic spoilage, and the action of pathogenic bacteria is one main factor of food insecurity.Around the monitoring of specific spoilage microorganisms in the circulation process, the research and development of safer, more efficient new materials, methods and technology represent difficulty in the field of aquatic freshness and quality safety. The objectives of this project are to understand the preparation technology of the epidermal mucus antimicrobial peptides of fish, and to investigate the inhibitory effects to the Shewanella putrefaciens and Vibrio parahemolyticus, which are the main harmful microorganisms in aquatic products. Agar penetration and reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) are used to screen and indentify the fish mucus antimicrobial peptides, new means such as proteomics, transmission electron microscopy and 16S rDNA DGGE means are used to investigate the dynamic change of the target microbial cell membrane structure and permeability, the protein synthesis, the metabolic activity, and the genomic DNA interactions. Therefore, anti-microbial mechanisms of mucus extracts will be interpreted clearly. Meanwhile, the epidermal mucus antimicrobial peptides will be tested on aquatic products, such as large yellow croaker, to observe the effects of fish flesh quality influenced by this newly bio-preservatives. The purpose of this study is to clarify the inhibition mechanism of the epidermal mucus antimicrobial peptides of fish, and lay a theoretical foundation for the construction of gene engineering bacteria, as well as their industrial products.

特定腐败菌（Specific Spoilage Organisms，SSO）是导致水产品腐败变质的主要原因，致病菌是导致食品安全的祸首之一。围绕贮藏流通过程中优势腐败菌的监控，研究开发更加安全、高效的新材料、新方法和新技术，代表着目前水产品保鲜及质量安全控制领域的研究重点和难点。本课题拟针对腐败希瓦氏菌和副溶血性弧菌等水产品中优势危害性微生物，采用琼脂渗透法和RP-HPLC分离纯化和鉴定出具有活性的鱼体表粘液抗菌肽,并利用蛋白质组学、透射电镜、16S rDNA DGGE等手段，通过测定目标微生物细胞膜结构和通透性、蛋白质合成、代谢活力、与微生物DNA相互作用等方面，探明粘液抗菌肽作用靶点，进一步阐明其抑菌作用途径及机制,同时将粘液抗菌肽应用于大黄鱼等水产品的保鲜，探究和验证其对水产品贮藏品质的影响。本研究旨在阐明鱼类体表粘液抗菌肽的抑菌作用机制，为下一步构建基因工程菌并工业化生产奠定基础。

水产品的品质及质量安全日益受到广泛关注，围绕贮藏流通过程中优势腐败菌的监控，研究开发更加安全、高效的新材料及新技术，代表着目前水产品保鲜及质量安全控制领域的研究重点和难点。本课题针对六种水产品主要致腐及致病菌，以鲶鱼体表粘液为材料，利用色谱分离纯化获得抗菌肽，并鉴定其结构，通过研究抗菌肽作用前后目标微生物的细胞膜、酶活性及蛋白质等变化，探究抗菌肽的作用机理，同时将抗菌肽应用于草鱼片的保鲜，探究和验证其对草鱼片贮藏品质的影响。本研究旨在阐明鱼类体表粘液抗菌肽的作用机制，为下一步构建基因工程菌并工业化生产奠定基础。.健康活体鲶鱼体表粘液经提取剂（0.2 M乙酸钠，0.2% Triton X-100，1 mM苯甲磺酰氟的水溶液）提取，利用C18固相萃取柱分离，筛选有抑菌活性的组分，再经过液相色谱多次分离纯化，得到鲶鱼体表粘液抗菌肽。通过氨基酸序列分析得到4个抗菌肽片段，分别为RIVELTLPRVSVR.L、KQEIILK.F、R.LKEKNK.A和R.QIKIXR.R，其中序列1分子量1381.9 U，同源于人类抗菌肽；序列2分子量 743.5 U，同源于美国专利抗菌肽6573361；序列3分子量759.5 U，同源于虎纹树蛙抗菌肽；序列4分子量786.5 U，同源于美国专利抗菌肽6127336。. 经抗菌肽处理的六种菌菌体干瘪、扭曲变形、表面凹陷、形成孔洞、细胞内容物流出和菌体裂解等现象。同时，抗菌肽能够明显降低六种细菌体内的AKP酶及Na+K+-ATP酶活性，严重损伤其细胞内、外膜。利用iTRAQ技术进行定量蛋白质组学研究，共鉴定1907个差异蛋白，定量的蛋白有1754个，其中上调蛋白共计294个，下调蛋白共计256个。对这些差异蛋白质进行功能分析表明，这些蛋白质主要参与了能量代谢、氧化还原反应等相关生物过程。.抗菌肽对草鱼腐败菌具有较好的抑制作用，能够显著改善贮藏期间pH值、TVB-N值、K值、表面颜色及质构特性，但对肌肉内水分的分布及迁移率没有显著影响，采用HS-SPME-GC-MS法对贮藏期内的样品进行检测，共检出挥发性成分129种，其中己醛、壬醛、1-己醇、1-辛烯-3-醇等为草鱼片的主要挥发性物质。抗菌肽处理组醛类低于对照组，醇类物质在贮藏后期出现少量，酸类物质所占比重相对增加，说明抗菌肽处理能够明显降低草鱼腥味以及其他不良挥发性物质的生成。