MTA3相互作用蛋白质的筛选及其信号通路的功能鉴定

胃癌的主要恶性生物学行为是侵袭和转移，这与MTA家族密切相关。MTA3与其他MTA家族成员不同，与抑制胃癌细胞转移相关，且其生物学功能仍多未知。本项目在构建MTA3野生型、变异型重组表达载体及收集部分临床胃癌标本的基础上，拟深入研究MTA3生物学功能特性,采用酵母双杂交体系筛选与其相互作用的靶蛋白, 应用免疫共沉淀、GST pull-down鉴定体内、体外环境下MTA3与靶蛋白的相互作用及作用位点；运用RNA干扰、酶活性检测、信号分子检测等技术鉴定其对靶蛋白信号通路的影响；综合运用MTT比色法、流式细胞术、Transwell、免疫组化等方法鉴定其通过靶蛋白信号通路对细胞周期、增殖、凋亡和胃癌细胞侵袭转移的影响。这将发现与MTA3相互作用的靶蛋白，鉴定其在此信号转导通路中的作用，揭示MTA3除转录调控外的新的作用机制，从而深入阐明其生物学功能，为抑制胃癌侵袭转移的药物靶标研发提供新的依据。

消化道肿瘤的主要恶性生物学行为是侵袭和转移，这与接头蛋白家族密切相关。由于胃癌是我国发病率较高的消化道肿瘤之一，因此本项目拟研究接头蛋白－MTA3在胃癌中的生物学功能，揭示其参与癌细胞胞浆中的信号转导通路。在前期实验中采用酵母双杂交、免疫共沉淀、GST pull-down等技术发现MTA3与ERα结合，但二者结合的亚细胞定位于细胞核而非细胞浆，提示在胃癌细胞中MTA3与ERα结合后的作用机制类似于其他癌症（例如乳腺癌），即通过转录调控Snail而抑制肿瘤的转移，这与项目设计目标有出入。然而在收集胃癌病例同时得到一部分珍贵的胆管癌病例，应用免疫组化技术发现和MTA3同为接头蛋白的Gab1与胆管癌的发生发展密切相关。进一步应用siRNA干扰、Western Blot、MTT、流式细胞术、Transwell等实验技术，发现Gab1或VEGFR-2被干扰后肝门胆管癌细胞（ICBD-1）以及肝内胆管癌细胞（RBE）内PI3K/Akt通路活性下降，随之增殖减弱、凋亡增强、侵袭力减弱等恶性生物学行为被抑制；提示Gab1可能通过VEGFR-2/ Gab1/ PI3K/Akt通路参与调节胆管癌细胞的增殖、侵袭、转移等恶性生物学行为。在恶性程度极高、极易转移的胆管癌中，对Gab1 可能参与的信号转导通路以及作用机制的深入研究，将有利于揭示胆管癌的发病机理，从而早诊断、早治疗，提高患者生存率。