水稻高频转座子nDaiZ的转座沉默与再激活机理研究

转座子是基因组的重要组成部分，明确转座子的转座沉默及再激活机理对研究基因组进化及功能基因组研究具有重要意义。nDaiZ/DaiZ转座系统是我们在水稻中鉴定得到的组培诱导的高频转座子，仅存在于水稻AA组染色体组中，在转座子家族中属于最年轻的一类，转座频率高达25％，有趣的是，在粳稻所有16个拷贝中，仅有一个拷贝在组培过程中被高效激活，籼稻所有11个拷贝在同等条件下均无活性。前期的研究结果表明这一沉默再激活过程与基因组DNA的去甲基化相关。目前对DNA转座子沉默及再激活的表观调控机制尚不明确。本项目在前期研究成果的基础上，利用单拷贝转座这一特殊性质，采用DNA甲基化、小分子RNA分析和Chip染色质免疫共沉淀分析，结合对关键基因的RNAi转基因研究，明确nDaiZ-DziZ系统的转座机理，并利用基因工程手段改造转座子，以期获得一个优良的插入突变诱导系统，为遗传学研究提供丰富的遗传资源。

转座子是基因组的重要组成部分，是基因组进化的主要推动因素之一。近几年的研究表明转座子的活动对基因表达调控具有相当重要的作用。因此，明确转座子的转座沉默及再激活机理对研究基因组进化及功能基因组研究意义重大。目前对DNA转座子沉默及再激活的表观调控机制尚不明确。nDaiZ/DaiZ转座系统是我们在水稻中鉴定得到的组培诱导的高频转座子，有趣的是，在粳稻所有16个拷贝中，仅有一个拷贝nDaiZ5-4(原nDaiZ9)在组培过程中被高效激活，这是目前报导的所有DNA转座子中唯一一个具有此特性的转座子。前期的研究结果表明这一沉默再激活过程与基因组DNA的去甲基化相关。本项目中，我们成功克隆了四个转座酶基因并体外表达获得了活性转座酶，in vitro实验表明nDaiZ转座子两个末端14bp的回文序列结构对转座子的活性起决定作用，仅单个碱基的突变就会完全抑制转座子的跳动。且4个转座酶中仅位于1号染色体的DaiZ1和7号染色体的DaiZ7具有较高的活性，DaiZ7活性最高。通过对正常植株（无转座活性）及愈伤组织（有活性）中转座子及旁侧位点的DNA甲基化水平分析，表明nDaiZ5-4特异位点的胞嘧啶去甲基化对其转座激活起到了决定作用，进一步研究表明，正常植株中nDaiZ5-4之所以转座沉默是因为在该特异位点存在一个天然siRNA,导致其始终处于甲基化状态。水稻中siRNA主要经DCL4剪切形成，在dcl4RNAi植株中，特异位点的甲基化消失，与愈伤中该位点的情况一致。对活性转座子位点侧翼组蛋白修饰分析结果表明，在愈伤组织中，活性转座子nDaiZ5-4的组蛋白修饰几乎消失，而其它沉默转座子位点的组蛋白修饰水平均比正常植株显著提高，综上，我们的研究结果表明DNA转座子nDaiZ5-4的单拷贝转座是由DNA去甲基化和组蛋白去修饰共同作用的结果，而这种特异位点的甲基化是由一个内源siRNA所介导的，从而阐明了转座子的转座沉默与再激活机理。同时我们成功改造了这一转座子并已获得了转基因后代，我们还获得了转座酶基因DaiZ7过表达转基因植株，杂交后期望能得到大量的转座子插入突变体用于功能基因分析研究。