VI型分泌系统Fha蛋白对霍乱弧菌溶血素HlyA活性的调节作用及分子机制研究

The pathological injury induced by Vibrio cholerae hemolysin (HlyA) is an important research content in the pathophysiology of cholera. To date, the regulatory mechanism of HlyA is not yet clear. Based on the previous research foundation of forkhead binding protein (Fha), we proposed the working hypothesis that "the FHA protein of the V. cholerae type VI secretion system affects the hemolytic activity of HlyA by regulating the expression of PrtV proteinase." The main research of this project involves：（1）The non-O1/non-O139 Vibrio cholerae fha knockout strains and revertants were used as model bacteria to observe the effects of fha gene on HlyA activity；（2）Analysis of transcriptome changes before and after fha gene knockout by RNA-Seq technology and screening for differential genes that regulate the activity of HlyA by Fha protein；（3）The △fhaΔhlyA and △fha△prtV double knockout and gene recovery strains were used as model bacteria to observe the effect of Fha protein on the expression of metalloproteinase PrtV, and the degradation effect of Fha protein through PrtV on HlyA degradation and pathological changes mediated by HlyA. It is expected that the results of the study will be of great significance for enriching the molecular pathogenesis of cholera and have potential value in seeking relevant intervention methods.

霍乱弧菌溶血素（HlyA）介导的病理损伤是霍乱病理生理学的重要研究内容。迄今为止，HlyA的调节机制尚不清楚。课题组基于前期有关叉头结合蛋白(Fha)的研究基础，提出了“霍乱弧菌VI型分泌系统FHA蛋白可通过调控PrtV蛋白酶的表达而影响HlyA溶血活性”的工作假说。本项目的主要研究涉及：①以非O1/非O139群霍乱弧菌fha基因敲除菌株和回复菌株为模型菌，观察fha基因对HlyA活性的影响；②通过RNA-Seq技术分析fha基因敲除前后转录组改变，筛选Fha蛋白调控HlyA活性的差异基因；③以△fha△hlyA、△fha△prtV基因双敲菌及基因回复菌为模型菌，观察Fha蛋白对金属蛋白酶PrtV表达的影响，以及Fha蛋白通过PrtV产生HlyA降解效应及HlyA介导的病理损伤变化。预期研究结果对丰富霍乱分子发病学理论有重要意义，对寻求相关的干预方法具有潜在价值。

溶血素HlyA是霍乱弧菌分泌的最主要溶血毒素，在霍乱弧菌的感染过程中发挥着多种重要作用。深入探讨HlyA调控的分子机制对防治霍乱靶向药物的研发具有重要意义。叉头蛋白结构域是经典的磷酸肽识别结构域，广泛存在于许多真核生物和细菌的调节蛋白中。FHA结构域蛋白编码基因存在于许多VI型分泌系统（T6SS）基因簇中，通常与丝氨酸-苏氨酸激酶(PpkA)和丝氨酸-苏氨酸磷酸酶(PppA)形成苏氨酸磷酸化系统，共同调控T6SS的组装和分泌。通过对已测序的细菌T6SS基因簇分析发现，包括霍乱弧菌在内的近1/4的细菌T6SS系统仅有FHA结构域蛋白编码基因，但无PpkA和PppA编码基因，在这些细菌中，FHA结构域蛋白发挥怎样的生物学功能，目前尚不清楚。本研究首次发现霍乱弧菌中VI型分泌系统相关FHA结构域蛋白TagH除了调控T6SS功能外，还在调控霍乱弧菌的溶血活性中发挥着重要作用。TagH主要在转录和翻译后水平负调控HlyA的表达。TagH的FHA结构域的磷酸肽结合位点在调节溶血活性中起关键作用。此外，TagH蛋白是霍乱弧菌的重要毒力抑制因子，tagH基因敲除能显著增强菌株的肠毒性和肠外侵袭致病能力，且主要依赖于霍乱弧菌溶血素HlyA。综上所述，根据我们的研究结果，提出TagH调控HlyA表达和T6SS的活性分子机制，即：在正常状态下（野生型），TagH促进T6SS组装和Hcp分泌；通过HlyU和Fur的协同作用抑制HlyA转录；并通过PrtV蛋白酶促进HlyA降解。在此状态下HlyA表达处于抑制状态。而在tagH敲除状态下（突变体），T6SS的组装和Hcp分泌受到抑制；hlyA的转录通过HlyU和Fur的精细调控而上调；prtV基因转录下调，导致HlyA降解减少。在此状态下HlyA的表达显著增强，导致细菌毒力明显增强。这项研究首次揭示T6SS和HlyA之间的联系，预期研究结果有助于加深对霍乱病因发病学的了解，对以此承续的探寻干预HlyA致病理损伤的方法具有潜在的价值。