尿液细胞重编程获得神经细胞的功能性离子通道发育与调控

Our laboratory successfully reprogrammed epithelial-like cells from human urine into neural progenitor cells (hUiNPCs). These transgene-free hUiNPCs can self-renew and differentiate into multiple functional neuronal subtypes and glial cells in vitro, which highlight their potential application in cell grafting in patients for treating neurological diseases. Neuronal activities mediated by ion channels and receptors , especially GABA induced depolarization, are thought to regulate the proliferation and differentiation of neural stem cells (NSC), thus manipulation of ion channels and receptors would change the behavior of NSC. The whole cell and perforated patch-clamp recordings are applied to characterize voltage-gated and ligand- gated ion channels in hUiNPC and differentiated neural cells at different developmental stages. The GABA excitatory/inhibitory shift and role of GABAb receptors in synaptic transmissions are also examined in the present study. The developmental mapping of functional ion channels and receptors will extend our understanding of the fate determination of NSC. The findings of the proposed study would help us optimize differentiation protocol of NSC and determine an optimal development stage for cell grafting, propelling the progression of the translational application of hUiNPC.

我们成功获得由人尿液上皮细胞转化来的神经前体细胞（hUiNPC），它们可以在体外自我更新并分化为神经元和胶质细胞。这种无病毒方式产生的hUiNPC以其高安全性在临床细胞替代治疗神经疾病上具有极大的应用前景。研究表明离子通道和受体控制的神经活动尤其是GABA介导的去极化调控着神经干细胞的增殖和分化，因此了解通道和受体的功能表达将有助于通过影响其活性调控hUiNPC的干细胞行为。本项目运用膜片钳技术记录hUiNPC以及其分化不同时期神经细胞上电压门控的K+、Na+和Ca2+通道电流以及谷氨酸和GABA门控的受体电流，了解 GABAa受体由去极化转为超极化作用的时间以及GABAb受体对突触传递和兴奋性的调节。功能性通道和受体的表达谱测定将加深对神经干细胞命运调控机制的认识, 有助于优化诱导分化条件和选择细胞移植时间窗口,推动hUiNPC的转化医学研究。

干细胞诱导分化而来的神经细胞在形态上表现出丰富的突起以及生理上表现为成熟的动作电位和突触功能。神经疾病患者的体细胞重编程为诱导多能性神经干细胞（iPS），进而分化为神经细胞，有助于在细胞和突触水平了解这些疾病的发生机制和设计治疗策略。iPS技术能够为需要细胞移植的帕金森病、精神分裂症和中风等患者提供足够的无免疫源性的细胞，实现个性化精准治疗。干细胞来源的神经元表现出输入特异性的长时程增强、内稳态可塑性及BDNF诱导的突触功能改变。大脑皮层的发育和功能受到广泛的单胺能调控。5-HT能纤维在大脑中广泛投射，并通过其复杂的受体亚型执行生理功能。大量证据表明iPS来源的神经元上存在谷氨酸和GABA受体，甚而有研究证明神经调质在干细胞增殖和分化中的重要作用，但是对5-HT受体在iPS诱导神经元上介导的功能调控研究却很少。理想情况下，移植的神经前体不仅要和宿主细胞建立联系，还需要其像宿主细胞一样接受神经功能调制。本项目运用全细胞膜片钳技术研究尿液肾上皮细胞来源iPS细胞分化成神经元上离子通道的功能发育以及5-HT受体对GABAa受体功能和抑制性突触传递功能的调节。根据项目计划书，主要取得以下研究成果（1）在早期1-2周，大部分神经元没有动作电位，在3-4周开始出现动作电位，但是动作电位的幅度较小，半波宽较大，并随着发育逐渐成熟，到4-5周具有成熟的动作电位，并且表达功能性神经递质受体以及形成突触连接；（2）5-HT和5-HT2A/C的激动剂（DOI）可逆的减少GABA电流；（3）该抑制作用需要G蛋白、PLC、PKC以及钙离子信号参与；（4）5-HT显著增强微小抑制性突触后电流（mIPSCs），但DOI却显著减少mIPSCs的频率和幅度。这表明在人iPS细胞来源的神经元上5-HT在突触后通过5-HT2A/C受体减少GABAa受体的功能，突触前其它5-HT2受体可拮抗5-HT2A/C受体作用。在人iPS来源的神经细胞5-HT功能受体的表达说明移植的前体细胞可执行正常功能以及作为细胞模型来筛选5-HT相关的精神类药物。另外，项目实施期间，还应用双膜片钳技术对共培养的神经干细胞与原代神经元形成的电突触和化学突触进行了探索。本项目实施期间，项目负责人以通讯作者或者第一作者共发表SCI 论文5篇(标注基金号)，完成任务计划书规定的主要指标。