人尿液细胞重编程为神经干细胞的命运决定分子机制及相关功能研究

Human neural stem cells hold great promise for research and therapy of the incurable neurological disease such as spinal cord injury, Parkinson's disease etc. In our previous work, we had developed an efficient approach to generate integration-free and expandable human neural progenitor cells using cells isolated from urine sample (UiNPCs). This approach enables autologous transplantation of patient-specific neural cells , thus draws great attention of the stem cell field. In this proposal, we will further work on the urine cell reprogramming to dissect the molecular mechanism of cell fate determination during this process. We aim to illustrate how neural fate or pluripotent cell fate was triggered in urine cells by the same reprogramming factors but with different external signaling pathways; refine the culture conditions that maintain the self-renewal of UiNPCs and explore differentiation potential of UiNPCs into specific neuron cell types; investigate how these cells incorporate into different local niches upon transplantation into various regions of the central nervous system. Our studies will not only provide insights in understanding the basic mechanisms of neural cell reprogramming but also facilitate their future application in regenerative medicine.

神经干细胞对于通过移植治疗脊髓损伤、帕金森病等神经系统疾病意义重大。在已有研究中，我们成功的建立了一套体外将病人尿液细胞直接重编程为神经干细胞的技术体系，引起了广泛关注。在本研究中，我们拟在这些前期研究的基础上，进一步详细研究和探索尿液细胞重编程过程中的命运转变调控机制。重点研究该过程中外源性信号分子如何与重编程因子相互作用调控重编程过程中的命运转变；并进一步优化和筛选尿液神经干细胞体外自我更新和向特定功能神经元及胶质细胞分化的最佳条件及机制；利用动物模型，研究尿液神经干细胞移植后在中枢神经系统不同部位的内微环境中的整合、分化、相互作用等体内功能及行为表现等。总之，本项目将通过系列研究，从分子-细胞-动物多个层次研究尿液神经干细胞的诱导机制、体外维持、体内功能等。这些研究对重编程过程中细胞命运转变调控的理论研究以及神经干细胞的进一步的应用都具有重要的意义。

人神经干细胞具有明显的基础研究优势和极大的临床应用前景。本项目在前期人尿液细胞转分化得到神经干细胞的研究基础上，紧密围绕项目研究内容，对细胞重编程以及神经分化过程进行了一系列的研究，包括技术体系的建立优化和相关分子机制的阐明。本项目研究成果主要有：1）通过TALEN技术建立了完整有效的基因修复技术体系，对地中海贫血基因进行有效修复，并验证了细胞重编程和基因修复操作对细胞基因组稳定性产生了一定的影响，重编程诱导中产生更多的拷贝数变异，而基因修复中产生了更多的单核苷酸变异。2）优化了尿液细胞重编程技术，通过P53抑制剂的添加将重编程诱导效率提升了一百多倍。3）在对尿液细胞转分化为神经干细胞分子调控机制的研究中，我们确认了TGF-β通路在诱导过程中起到了关键性的调控作用，诱导早期，TFG-β通路通过下游靶标SNAI1激活EMT从而抑制重编程，诱导后期，TGF-β通过SMAD2促进细胞重编程为iPS（OCT4+），而持续抑制TGF-β，细胞则由于高表达的SOX2转变为神经干细胞（OCT4-）。4）建立了人多能干细胞诱导分化为神经干细胞的技术平台，并在此基础上，对多能干细胞的神经分化调控机制进行研究。发现了神经分化过程中miR-376C通过与SMAD4相互拮抗的作用调控神经分化的发生。另外，我们确认了神经分化过程中OTX2是促使细胞的默认神经分化特性偏向前脑的关键因子，而在后脑分化过程中，由于WNT通路的调控导致NANOG的下调被短暂阻滞，从而与GBX2共同抑制OTX2，促进细胞向后脑转变。本课题建立了细胞重编程，神经干细胞诱导以及基因编辑相关技术体系，阐明了人尿液细胞转分化和神经分挂过程的分子调控机制，对于稳定高效诱导神经干细胞并最终应用于干细胞的临床治疗提供了科学的依据。