序贯诱导重编程的自体多潜能干细胞分化为视网膜神经细胞

自体细胞重编程来源的多潜能干细胞(iPS)在再生医学中有重要的应用前景。为了探索体外诱导iPS细胞向视网膜神经细胞定向分化的新方法，本课题采用序贯诱导策略，首先利用RA、DKK1和LeftyA等因子的组合，诱导小鼠iPS分化为Pax6+视网膜神经前体细胞，检测诱导后的Pax6+前体细胞中视网膜祖细胞相关基因表达水平，优化出最佳诱导方案；然后在Pax6+前体细胞中过表达Math5基因，以诱导iPS定向分化为视网膜神经细胞或神经节细胞，并从形态学、基因表达、蛋白表达、电生理功能等方面对诱导后的细胞进行分析；进一步将诱导后的细胞移植到小鼠视网膜下腔，观察其在视网膜内的整合分化情况。本课题将为神经致盲性眼病的自体细胞替代治疗提供新的策略和理论基础。

本课题采用序贯诱导策略，在体外诱导小鼠成纤维细胞重编程为多潜能干细胞，重编程获得的iPS细胞不仅在形态、增殖能力与小鼠胚胎干细胞（ES）相似，表达AP、SSEA-1 and Nanog等ES细胞表面标记和ES标记基因，且表达视网膜祖细胞相关基因(如Pax6, Otx2, Lhx2 和RX )。之后通过高表达Math5，并添加Dkk1、Noggin和DAPT促进小鼠iPS靶向分化，发现分化的iPS细胞表达视网膜神经节细胞特异性标记。将诱导后的细胞移植到小鼠玻璃体腔，发现多数移植细胞聚集在注射部位，并表达Map2、Syn、Brn3b与Thy1.2。此外，在国内外首次采用短暂的血清饥饿法序贯诱导细胞周期同步化，证实能显著提高逆转录病毒转染效率，使Nanog阳性iPS克隆增加15-20倍。并进一步在体外诱导人Tenon’s 囊成纤维细胞重编程为多潜能干细胞，证实HTF重编程来源的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达及畸胎瘤生成能力等方面都与人胚胎干细胞相似。以上研究为视网膜神经细胞损伤性疾病细胞替代治疗的临床应用提供了坚实的基础。