腺相关病毒的定向进化以选择稳定有效转导心脑血管内皮载体的研究

心脑血管疾病常涉及血管内皮的功能异常，因而靶向内皮的基因转移成为血管疾病治疗的热点。腺病毒对血管内皮的转导效率较高，但其引起的免疫反应和短暂的转基因表达限制了其进一步的应用。腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）能稳定转导多种组织并具有较高的安全性，但其对血管内皮的转导效率较低。本项目拟对AAV不同血清型的衣壳蛋白基因进行DNA shuffling以构建具丰富多样性的病毒文库，将AAV文库在小鼠体内进行多轮选择以分离心脏和脑血管内皮富集的AAV。然后利用这些衣壳蛋白基因包装重组AAV-lacZ载体以检测它们在体内和体外对小鼠心脑血管内皮的转导效率。将有效转导心脑血管内皮的AAV载体结合内皮特异的Flt-1启动子转运内皮一氧化氮合成酶基因到自发性高血压大鼠体内以改善内皮功能和治疗高血压。最终获得能有效和长期转导血管内皮的AAV载体以用于心脑血管疾病的基因治疗。

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）由于其较好的安全性和较高的转导效率已经在临床上被用于遗传性眼盲和血友病B的基因治疗。然而其在心脏病基因治疗中的应用有待挖掘。值得注意的是，血管内皮在粥状动脉硬化和冠心病等疾病的发生中有着重要角色，因而靶向内皮的基因治疗具有广阔的应用前景。然而AAV对心脏血管内皮的转导效率相对较低。..本项目研究着眼于以定向进化的方法来提高AAV对心脏血管内皮的转导效率。具体而言，我们首先用DNA shuffling对AAV血清型的衣壳蛋白基因进行了改造，然后构建了自包装的AAV文库。同时采用组织贴块法分离了原代大鼠心脏血管内皮，然后将AAV文库在这个体外模型上进行了两代筛选。结果获得了一个命名为AAVEC1的新的AAV，并比较了它与另外两种AAV血清型在体外和体内转导心脏血管内皮的效率。在原代大鼠血管内皮上，三种AAV变异株的转导效率为AAV2>AAVEC1>AAV1，在小鼠体内，三种AAV转导心脏血管内皮的效率为AAV1>AAV2>AAVEC1。..这一研究结果提示AAV变异株在体外和体内转导血管内皮的能力并不相同，同时为了得到具有基因治疗应用潜力的AAV载体，我们必须选取体内动物模型来进行AAV载体的定向进化。目前我们已经订购了Tie2-GFP转基因小鼠以进行进一步的研究。