HBV X、MHBst蛋白调控p15/p16/RB通路与细胞增殖的分子机制及干预研究

根据p15/p16/RB控制细胞周期及乙型肝炎病毒（HBV）诱导p15/p16/RB甲基化并与肝癌密切相关的现象,本项目研究HBV X蛋白（HBx）及羧基端缺失的中表面蛋白（MHBst）对p15/p16/RB基因甲基化、表达的影响及与RB蛋白的直接结合作用；研究HBx、MHBst对细胞DNA甲基转移酶的转录激活作用；研究HBx、MHBst是否通过抑制p15、p16而调控RB蛋白磷酸化及功能；研究HBx、MHBst是否通过对p15/p16/RB的抑制而调控细胞周期与增殖。进而在肝癌细胞及裸鼠肝癌皮下移植瘤模型研究针对HBx与MHBst的干扰RNA及DNA甲基转移酶抑制剂对p15/p16/RB通路的激活及对肝癌细胞生长的影响。旨在揭示HBx、MHBst调控细胞增殖的分子机制与阻断措施。这对于阐明HBV致细胞癌变机制及研制肝癌新型治疗手段有重要作用,具有较大科学意义及潜在应用价值。

本项目成功建立了稳定表达HBV X、缺失突变HBV X、羧基端缺失的HBV中表面蛋白（MHBst）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系HepG2/GFP-HBx, HepG2/GFP-HBxn、GFP/HBxc、HepG2/GFP-MHBst78及HepG2/GFP-MHBst155细胞系，为研究HBV X、MHBst的生物学功能及在HBV感染致病中的作用提供了研究平台。研究了HBV X、缺失突变HBV X 、MHBst78及MHBst155对肝癌细胞生长、周期、凋亡的影响。研究了其对p16甲基化、p16、RB表达磷酸化的影响，研究了HBV X、MHBst对DNA甲基转移酶（DNMT）1、3a、3b基因启动子活性及表达的影响。最后，在裸鼠肝癌移植瘤模型研究了HBV X的致瘤作用及针对HBV X的干扰RNA(X-siRNA)及甲基化抑制剂5-Aza-CdR对肝癌细胞生长及p16甲基化、表达的影响。研究发现，HBx、MHBst155能加快HepG2肝癌细胞周期、促进细胞生长，并发现该作用是通过其诱导p16基因甲基化、降低p16表达及促进RB磷酸化所致。进一步研究发现，HBx、MHBst155通过转录激活DNMT 1、3A基因启动子活性，提高DNMT 1、3A表达水平，从而诱导p16基因甲基化，目前尚未见文献报道。研究发现HBx能抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。阐明了HBV X分子结构域与其调控细胞周期的功能的关系,研究发现羧基端缺失50个氨基酸的HBx具有抑制p16表达及促进肝癌细胞增殖作用，而氨基端缺失50个氨基酸的HBx不具有促进肝癌细胞增殖能力，提示HBx的氨基端可能在调控肝癌细胞增殖过程中起更重要的作用。进一步在裸鼠研究发现HepG2/GFP-HBx组的皮下移植瘤体积明显大于HepG2/GFP组；HBV X的干扰RNA(X-siRNA)与5-aza-dC处理的移植瘤体积明显小于未处理组；同时，HepG2/GFP-HBx组移植瘤组织存在p16甲基化而HepG2/GFP组未检出p16甲基化；X-siRNA、5-aza-dC 处理的移植瘤组织中p16基因甲基化减低。提示HBV X加快肝癌细胞生长，而针对HBV X的干扰RNA及甲基化抑制剂能够有效抑制肝癌皮下移植瘤细胞生长，具有潜在应用价值。