多策略联合驱动腺相关病毒（AAV）定向进化以高效感染并基因修饰T细胞

Cytotoxic T cell with gene modification can play a stronger anti-tumor effect, but the gene delivery vectors, lentivirus and retrovirus, are of several drawbacks such as random integration. Adeno-associated virus (AAV) is a kind of safe and efficient vector, however, showing limits in infecting T cell. Reconstruction of viral capsid structure could result in high efficient transduction of target cells.However,capsid reconstruction needs much information of viral structure, otherwise inappropriate modification can cause the virus packaging failure, prone to be degradable and so on. Simulation of natural evolutionary selection process as a screening method for new viral vectors can effectively avoid the lack of knowledge on virus structure and function, and can also deepen the understanding of the virus structure, packaging, and cell surface receptors. Our research group once carried out site-directed modification and random peptides insertion mutagenesis of serotype 2 and 8 AAV vectors. In this projection we will further amplify the chimeric AAV library that was established by our preliminary studies using DNA shuffling technology, meanwhile construct a random peptides display library and a random nucleotides mutation library of AAV. These multi-strategies combined drive the directed evolution of AAV to efficient delivery full length antibody gene into T cell for tumor therapy. The implementation of this project could explore the AAV usage in T cell research and application, and rich information of virus function and structure.

基因修饰的细胞毒性T细胞可发挥更强的肿瘤杀伤效果，但是其基因修饰载体逆转录病毒或慢病毒存在随机整合等不足。腺相关病毒（AAV）是一类安全有效的载体，却对T细胞几乎不感染。病毒通过外壳结构改造可以达到对靶细胞的高效感染，但这需要掌握丰富的病毒结构信息，否则不恰当的改造容易造成病毒包装失败或易降解等问题。模拟自然进化选择的过程作为筛选手段，可以有效避免对病毒结构功能认识不足的限制，在获得新病毒载体的同时可以加深对病毒结构、包装以及细胞表面受体等信息的认识。课题组以往开展了对2型及8型AAV的定点修饰及随机肽段插入突变的工作，本项目欲进一步完善前期研究中用DNA shuffling技术建成的嵌合AAV文库，同时建立随机肽段展示文库和随机碱基突变文库，联合定向进化AAV以高效感染T细胞并表达全长抗体基因杀伤肿瘤。本项目的实施可拓展AAV在T细胞中研究与应用，丰富病毒功能与结构信息。

免疫治疗研究炙手可热，免疫抗体（PD-1/PD-L1抗体、CTLA-4抗体等）和免疫细胞（CAR-T、TCR-T、DC-CTL等）在临床治疗上已经取得重要进展。T细胞是肿瘤免疫治疗的基础，安全有效地改造T细胞的技术已经成为各药企和研究机构的核心竞争领域。当前对T细胞的基因改造主要利用整合型病毒载体（如lentivirus）和电转染具整合功能的质粒载体。腺相关病毒（AAV）是一类广泛应用的非致病性载体，已经有AAV的基因治疗药物上市（如欧盟的Glybera）。另外，还有获得FDA突破性疗法认证的AAV载体药物，包括治疗乙型血友病的SPK-9001，治疗I型脊髓性肌萎缩症的AVXS-101，治疗RPE65基因突变的遗传性视网膜疾病的Voretigene Neparvovec（也称为 SPK-RPE65），Voretigene Neparvovec有望在2017年正式上市。AAV对T细胞感染效率很低，尚未见有报道利用AAV对T细胞基因修饰。基于AAV在疾病治疗上的安全性和成功应用，以及当前T细胞修饰载体慢病毒和质粒存在的随机整合和GMP生产方面的局限，本研究利用定向进化的AAV重组技术，AAV2随机肽段文库，AAV定点突变文库筛选高效感染T细胞的腺相关病毒；通过对野生型和突变型AAV载体的比较，对T细胞培养的刺激因子、细胞浓缩、紫草素和病毒滴度等条件的优化，最终实现了AAV病毒高效感染T细胞。AAV6-Y705-731F+T492V，AAV-DJ-S662V+Q458K+S492K以及AAV-DJ-CD4等突变载体均展现出了较高的T细胞感染效率，奠定了基于AAV修饰T细胞的研究和治疗应用的基础。我们用筛选的AAV病毒对原代培养的细胞因子激活T细胞、DC-CTL以及肿瘤浸润性T细胞（TIL）进行了不同批次细胞的感染，其感染效率最高可达90%以上（以往报道不超过10%的效率）。基于上述工作，我们构建了AAV-anti/PD-1和AAV-PiggyBac整合酶载体系统，用于在T细胞中表达治疗性PD-1抗体和制备CAR-T细胞。这将为后续利用AAV基因修饰T细胞开展基础和应用研究奠定基础，有望获得具有自主知识产权的新型CAR-T细胞制备技术。