非综合征型先天性缺牙新致病基因的鉴定及功能研究

Tooth agenesis is a common dysplasia in human beings, which seriously affects the masticatory function and even the physical and mental development of the patients. Because of the complexity of gene regulatory network in tooth development, it is a difficult problem to check disease-causing genes in this field. At present, the detection rate of non-syndromic tooth agenesis is very low. This research group have collected clinical data and peripheral blood of a 25-persons family which is the acquisition of non-syndromic tooth agenesis in previous work. Using whole exome sequencing, STR linkage analysis, family co-separation experiment and zebrafish test, we find a new and never reported gene and gene mutation of disease, which is not clear about the mechanism of the effect of tooth development. This study would use CRISPR/Cas9 gene technology to establish a transgenic mouse model of disease-causing genes to detect new genes of the family, and establish a cell model to study the interaction of gene and protein in combination, explore the disease-causing gene in the molecular pathogenesis of tooth agenesis. Using the rich source of information could study this field further. Studying on gene and protein function which is newly discovered, from the analysis of the disease to the growth mechanism of tooth agenesis, it could provide a theoretical basis for genetic counseling, non-syndromic oligodontia prevention and gene therapy.

先天性缺牙是人类常见的发育异常，严重影响患者的咀嚼功能，乃至身心发育。由于牙齿发育的基因调控网络的复杂性，寻找其致病基因，一直是该领域的难点。目前非综合征型先天性缺牙的致病基因检出率极低。本课题组在前期工作中采集了一个25人的非综合征型先天性缺牙家系，通过全外显子测序、Sanger 测序、STR连锁分析、家系共分离及斑马鱼试验，提示可能找到了一个从未报道的新致病基因及突变，该基因及突变对牙齿发育的影响机制尚不明确。本研究拟对患病人群和正常人群进行致病基因筛查并采用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立转基因小鼠模型以明确该基因为致病基因，并通过基因芯片筛查出可能信号通路，建立细胞模型和小鼠模型对可能信号通路进行检验，探讨该致病基因在非综合征型先天性缺牙中的分子发病机制。以期为非综合征先天缺牙的遗传咨询、预防和基因治疗提供理论依据，从疾病分析入手，解密牙齿的生长发育机制。

先天缺牙是最常见的牙列发育异常，而非综合征先天少数缺牙是所有先天缺牙类型中最常见的一种，大多数患者有遗传背景。先天缺牙不仅影响患者的容貌、发音和咀嚼，严重者甚至会影响其生活质量。本研究以一个来自中国江西的非综合征先天缺牙家系为研究对象，对家系中的患者进行临床及影像学检查，确立临床诊断；对该家系致病基因突变进行筛查和确认，对突变蛋白以及致病基因在牙齿发育过程中的作用进行功能研究，探讨致病基因在非综合征先天缺牙中的分子发病机制。主要研究结果如下：.1.通过对该家系先天缺牙患者进行临床检查和病史调查，发现该家系所有患病成员均表现为不同数目和部位的牙齿先天缺失，并未发现身体其他部位的先天发育异常。由于所有缺牙患者牙齿缺失数目除第三磨牙外少于6颗，因此诊断为非综合征先天少数缺牙。.2.本实验在非综合征先天少数缺牙家系中发现DSP基因的一个错义突变.（rs6929069，c.5213 G>A），该突变导致1738号精氨酸突变为谷氨酰胺（p.R1738Q），家系正常对照个体中都不存在该突变。该突变未导致蛋白的二级结构和三维构象发生改变，但突变位点氨基酸在不同物种之间高度保守。 .3.亚细胞定位结果显示在野生型DP和突变DP均定位在胞浆中，说明突变蛋白未改变了其在细胞中的原有的定位；体外蛋白水平表达结果突变蛋白比野生蛋白的半衰期长，在细胞中更加稳定，突变蛋白在细胞中的长期稳定存在干扰了Wnt/β-catenin信号通路的转导。.4.DP蛋白在间充质来源的hDPSCs中高度表达且DP功能丧失后抑制了hDPSCs生物学特性的正常发挥；.通过敲低斑马鱼同源基因dspa的表达成功复制了先天缺牙表型；而且牙齿早期发育相关基因dlx2b、pitx2、bmp2a的表达均出现不同程度下调，提示DSP可能是一个新的先天缺牙致病基因并在牙齿发育中发挥重要作用。