单纯性Ⅱ型房间隔缺损家系致病基因的定位与克隆

随着基因组科学的进展，抢救性收集并利用我国珍贵的单基因遗传病家系资源发掘新的致病基因显得越来越紧迫。近年来，本课题组一直致力于单基因遗传病家系的收集与研究。申请者最近收集到一个常染色体显性遗传单纯性Ⅱ型混合型房间隔缺损家系，类似房缺大家系国内外少见报道。课题组前期通过候选STR标记连锁分析以及测序筛查排除了该家系与已知先天性房缺相关染色体位点和基因的关系。本研究计划以该家系为研究对象，采用染色体定位结合全基因组外显子捕获深度测序策略，首先进行全基因组STR连锁分析将致病基因定位到一个染色体区段，接下来通过全基因组外显子捕获深度测序技术筛选致病基因及其突变，最后在300例先心病病例和正常对照中进行致病基因验证。致病基因的克隆将为下一步开展致病基因的功能研究，阐明先天性房缺发病机制打下良好的基础。

本研究收集到一个房间隔缺损大家系，首先进行了临床资料的收集、整理和分析，明确其为常染色体显性遗传方式，表型确定为先天性单纯性Ⅱ型房间隔缺损。前期通过sanger测序在其中两例患者样本中筛查了目前已知与房缺相关的10个疾病基因（GATA4、GATA6、NKX2-5、MYH6、ACTC1、TBX20、TBX5、TLL1、CITED2和CRELD1），结果未发现致病变异。之后又通过aCGH在两对“患者vs对照”样本（Ⅲ3vsⅢ5和Ⅴ2vsⅤ3）中进行了全基因拷贝数变异分析，结果未发现共有的大片段致病变异存在。.通过基于SNP芯片的全基因组连锁分析，结合候选区域STR连锁分析，将致病基因定位到8q24.12-24.22，位于rs6987567与rs11995895之间约13.1cM的区域。对家系中3名先天性房缺患者（Ⅲ3、Ⅴ2和Ⅴ4）和1名健康对照（Ⅲ5）进行了外显子组捕获测序，随后进行了高通量测序数据的分析与注释，结果筛选出20个在患者中共有而对照中没有的编码区非同义变异，而家系分析发现这些变异均无法得到共分离。因此该家系致病变异可能位于非编码区。随后，结合家系疾病基因定位的结果，在高通量测序数据中进行8q24.12-24.22区域的变异筛选，结果在MYC基因第2内含子区发现了一个变异位点c.802-96C>T，该位点在数据库中未见报道，并且在家系中该变异位点与房缺表型共分离（即在家系所有患者中检测到而在所有对照中均未出现）。此外，分析了200例正常对照样本，同样没有检测到该变异位点。该位点在哺乳动物中高度保守，可能是该家系的致病变异，但需要进一步体内和体外的功能试验进行证实。.由于本项目的依托和来源建立于遗传病家系资源库，因此在本项目研究过程中还进行了其它相关遗传病家系的收集和研究。发现了1例脊髓小脑共济失调合并房间隔缺损家系，并分别鉴定了其致病基因；采用连锁分析将1例虹膜缺损大家系的致病基因定位到11p13，并通过aCGH和real-time PCR发现PAX6基因下游的大片段缺失是其致病变异；鉴定了1例由LMNA基因突变导致的罕见非典型早衰综合征；通过表型鉴别、连锁分析、候选基因筛查以及功能研究，克隆了1型3亚型并指畸形的致病基因。