伪狂犬病毒UL54蛋白核定位信号和核输出信号的确定及其生物学功能研究

伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）能够引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病，猪为其自然宿主。该病在猪群中的传播和流行给养殖业造成了巨大的经济损失。早期蛋白UL54为PRV三个早期基因表达产物之一，前期研究表明UL54定位于细胞核中，但其准确定位以及定位机制、转运机制、生物学功能尚不清楚。本项目拟采用病毒感染和构建UL54与增强型黄色荧光蛋白（EYFP）融合的真核表达质粒转染细胞来确定UL54在活细胞内的准确定位；构建UL54的缺失及定点突变体来鉴定UL54的核定位信号（NLS）和核输出信号（NES）；分别通过麦胚凝集素/Ran-GTP突变体抑制实验和leptomycin B药物处理抑制实验，初步探讨该蛋白的核定位及核输出的转运机制；进一步构建NLS和NES缺失病毒，研究UL54的核定位及核输出信号在病毒复制中的作用，从而为阐明UL54的在感染中的生物学功能奠定基础。

伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）能够引起多种家畜和野生动物的伪狂犬病，猪为其自然宿主。该病在猪群中的传播和流行给养殖业造成了巨大的经济损失。早期蛋白UL54为PRV三个早期基因表达产物之一，前期研究表明UL54定位于细胞核中，并且含有一个可以结合RNA的RGG基序，但其准确的亚细胞定位信号、定位机制、转运机制及生物学功能尚不清楚。本项目发现UL54在单独转染以及感染的细胞内主要定位于核仁。通过构建UL54的缺失及定点突变体鉴定出了UL54的核定位信号（NLS, 61RQRRR65）以及核仁定位信号（NoLS, 45RRRRGGRGGRAAR57）；异源核融合实验证实了UL54是一种核质穿梭蛋白； Ran-GTP 显性负突变体、Leptomycin B处理以及免疫共沉淀等实验表明该蛋白通过TAP/NXF1而非CRM1依赖的核输出途径及依赖于Ran的核输入转运机制进行核质转运；通过构建NLS以及NoLS的单缺失和双缺失重组病毒，证实了UL54的核输入在病毒复制、增殖和调控病毒基因的表达中起着至关重要的作用，从而为阐明UL54在病毒感染中的生物学功能奠定了基础。