房缺相关非编码区新致病变异的鉴定与功能研究

Congenital atrial septal defect (ASD) is the most common birth defect in China and also the main reason for infant death and deformity. In addition to environmental factors, the occurrence of ASD has obvious genetic predisposition. Current genetic research of ASD focus on the identification of the associated genetic variants. Monogenic disease family is undoubtedly the best research model. Recently, the biological function of noncoding DNA becomes the hotspots in the field of functional genomics, which gets more and more attention. The pathogenic gene of an ASD family was located to 8q23.3-24.13 region by genome-wide linkage analysis by our group previously. However, the pathogenic variants in the coding regions were excluded by whole exome sequencing and genome-wide aCGH assay. Then a highly conserved candidate pathogenic variant (c.802-96C>T) was discovered in the second intron of c-MYC gene, which was cosegregated with ASD phenotype in this family. c.802-96C>T was also not reported in the database and not found in the normal controls. This project intends to study the functional significance of this variant in iPSC model which is constructed from the fibroblast cell of the ASD patient. Then study the mechanism of action of this variant in the process of heart development by gene knockin animal model. This reasearch may be helpful to understand the functional roles of the noncoding DNA elements and the pathogenesis of congenital heart disease.

房缺是我国最常见的出生缺陷，也是婴幼儿致死致残疾的重要因素。除环境因素外，房缺的发生有明显的遗传倾向。房缺的遗传学研究集中在疾病相关遗传变异的发掘与鉴定，单基因病家系无疑是最佳研究模型。近年来，非编码序列的生物学作用日益受到重视，形成功能基因组学的一大研究热点。申请者前期对一个房缺家系展开了研究，通过全基因组连锁分析将致病基因定位到了8q23.3-24.13区域，经全外显子组测序和全基因组CNV分析排除了编码区变异，但在c-MYC基因第2内含子发现了一个候选致病变异c.802-96C>T。该变异与家系房缺表型共分离，在数据库以及正常样本中也均未发现，并在脊椎动物中高度保守。本研究拟采用房缺病人来源的iPSC细胞作为体外模型研究该致病变异的功能意义，并通过制备基因敲入动物模型研究其在心脏发育过程中的作用机制。研究结果将为认识非编码DNA的功能以及先心病的发病机制提供新的证据。

房缺是我国最常见的出生缺陷，也是婴幼儿致死致残疾的重要因素，其发病有明显的遗传倾向。单基因病家系是研究疾病相关遗传变异的最佳模型。本研究基于前期所研究的一个常显遗传的房间隔缺损大家系，确定表型后，通过全基因组连锁分析以及候选区域STR连锁分析，将致病基因定位到5q35.1。通过对家系中3名患者（QY-V2，CSP-III3，ZLN-V4）以及1名正常对照（QKF-V3）的全基因组高通量深度测序数据进行分析，发现5q35.1区域先心病相关基因NKX2-5存在剪切突变c.335-1G>A（g.chr5:173233210 G>A），该突变与家系表型共分离，在哺乳动物中高度保守，在多态性数据库、正常对照以及先心病患者中均未见报道。采用家系患者CGQ-Ⅳ8的心脏组织，提取总RNA并进行RNAseq，基因表达分析发现NKX2-5基因表达总丰度为57.7，野生型产物表达丰度为18.1，提前终止产物表达丰度为18.2，延后终止产物表达丰度为21.4，明确了剪切突变对基因转录的影响。为进一步明确不同转录产物（突变体）对心脏发育的功能意义，构建了家系房缺患者（QY-V2）来源的iPS 细胞株，并进行了鉴定。此外还借助正常iPSC（PGP1细胞株）与基因编辑技术获得了NKX2-5基因敲除的iPS细胞模型。基于以上获得的iPSC 细胞模型进行了定向诱导心肌分化，针对获得的iPSC来源的心肌细胞，目前正通过RNASeq和膜片钳实验对NKX2-5突变体的功能进行深入研究，以阐释房间隔缺损以及致死性心律失常的发生机制。.本项目依托并来源于遗传病家系资源库，本项目还进行了其它相关遗传病家系的收集和研究。在121例遗传性视神经炎患者中发现35例存在致病变异，包括33例线粒体突变和2例OPA1基因新突变；采用全基因组连锁分析和纯合子定位将1例共济失调伴智力障碍家系的疾病病基因定位到一个新的染色体区域5q12.1，并通过全外显子组测序发现了ERCC8基因的一个新纯合致病变异；发现了1例常染色体显性遗传的肥厚性心肌病家系，通过全外显子测序和mRNA表达分析，鉴定了一个已知心肌病相关基因MYBPC3的新变异位点，并评价了其功能意义。