无囊膜病毒诱导细胞融合机制的研究

Membrane fusion is an important event in many biological processes. Except for the fusion events between the virus envelop and the cell membrane induced by entry of enveloped viruses, nonenveloped viruses also can mediate cell-cell membrane fusion during infection. But the detailed mechanism has not been determined. This study will focus on the fusion protein NS16 encoded by grass carp reovirus. Firstly, immunofluorescence assay, membrane fractionation assay and inhibition assay will be performed to determine the membrane localization and the transportation pathway. Secondly, a series of deletion and point mutations will be constructed based on bioinformatic analysis to identify the important motifs and necessary amino acids. Colocalization assay and Co-Immunoprecipitation assay will be utlized to investigate whether the NS26 protein enhance the fusion activity of NS16 through direct interaction. Finally, the expression of NS16 will be repressed by RNA interference to study the influence on viral infection and spreading, and investigate the contribution of membrane fusion induced by NS16. This will lay a foundation for elucidating the cell-cell fusion mechanism mediated by nonenveloped viruses.

膜融合在许多生物学过程中都具有重要意义，除了有囊膜病毒进入细胞过程引起的病毒囊膜与细胞膜的融合外，无囊膜病毒也能够介导细胞与细胞之间的融合，但其具体的机制尚未阐明。本项目拟以草鱼呼肠孤病毒编码的融合蛋白NS16为研究对象，通过免疫荧光、细胞膜提取及药物处理实验研究NS16的膜定位及其在细胞内的运输途径；在生物信息学分析基础上构建一系列的缺失及定点突变体来鉴定NS16重要的结构域和关键氨基酸；通过荧光共定位和免疫共沉淀技术研究NS26是否通过直接的相互作用增强NS16的融合功能；进一步通过RNAi技术抑制NS16的表达来研究其对病毒复制及播散的影响，阐明NS16介导的膜融合在病毒感染中的功能，从而为解析无囊膜病毒诱导细胞融合的分子机制奠定基础。

无囊膜病毒侵入细胞的过程不依赖于膜融合的发生，但是少数的无囊膜病毒在感染过程中也能引起细胞的融合形成多个细胞核的合胞体。本项目以无囊膜的草鱼呼肠孤病毒为研究对象，在前期发现该病毒编码的非结构蛋白NS16能够引起细胞与细胞之间的膜融合的基础上，确认了NS16蛋白的膜定位，检测了其在转染及感染细胞中的分布；发现另一非结构蛋白NS26能够通过与NS16相互作用以及增加NS16的表达量的方式来增强NS16的膜融合活性；生物信息学分析发现NS26蛋白中存在着一个TLPK motif对增强NS16的膜融合活性非常关键，并且该motif中的保守氨基酸K对功能的发挥最为重要；TLPK motif的缺失阻止了NS26与溶酶体的共定位以及与溶酶体蛋白的互作，同时也显著削弱了NS26蛋白对NS16蛋白功能的增强；进一步通过构建NS16的缺失及定点突变体，发现NS16的N端前14个氨基酸以及胞外区的第22、23位氨基酸CC和跨膜区第57、58位氨基酸CC对膜融合功能的发挥非常重要；通过药物抑制实验发现NS16蛋白通过内质网-高尔基体的运输途径到达质膜，为进一步阐明无囊膜病毒诱导细胞融合的分子机制奠定了基础。