糖基转移酶高通量鉴定方法的完善与应用

Glycosyltransferase (GT) is responsible for the biosynthesis of carbohydrates. Exists in all species, carbohydrate directly or indirectly related with the other three widespread macromolecules in all domains of life, therefore, identification of GT are significant in understanding several biological processes. There are more than 110,000 GT genes in sequenced genomes, whereas only around a hundred have been chemically characterized, mainly because that the activities of GT are hard to predict and traditional identification approaches are laborious and complex. We have recently developed a high-throughput approach which combining rapid gene cloning technique, cell-free protein expression technique, and high-throughput MALDI analysis technique to identify GT. The work has been published by Nature Chemical Biology (2012,8,769). This proposal is mainly focused in the further improvement and application of the approach. Streptomyces griseus belongs Streptomyces, which accounts for 90% of antibiotic producing strains in Actinomycete. Till now, there are few studies on the biosynthesis of sugars of Streptomyces. In this proposal, we will characterize the 59 putative GTs in Streptomyces griseus by using the improved high-throughput GT identification approach, which may pave the road in understanding and utilizing the biosynthetic pathway of its carbohydrates.

糖基转移酶（GT）是合成糖类的主要酶类。糖类广泛存在于所有物种中，并与其他三种生物大分子（蛋白/核酸/脂类）都具有直接或间接的关系，因此GT的鉴定对于了解各个生物过程都具有重要意义。GT数量庞大，目前已测序的基因组中有11万余个，然而已被鉴定的不过百余种。主要原因是GT活性预测困难,且传统的鉴定方法繁琐复杂。我们结合基因快速克隆，蛋白体外表达以及高通量的检测技术，首次实现了非标记的高通量GT的鉴定，该工作已被Nature Chemical Biology（2012,8,769）发表。本申请所述工作主要是对该技术的完善和实际应用。链霉菌属是最高等放线菌，已知放线菌产生的抗生素90%为本属产生。目前对该属菌种糖类和GT的研究甚少，本申请将使用完善后的高通量鉴定技术对灰色链霉菌（链霉素工业生产菌种）中59个GT及基因进行鉴定，希望能够对糖类的研究提供依据和基础。

碳水化合物 (Carbohydrate)，包括寡糖、多糖以及糖缀合物广泛存在于所有生命体中，并在诸多重要的生物学过程中发挥关键作用，包括细胞迁移和细胞因子作用、肿瘤发生及发展、病原微生物感染、免疫反应包括炎症和自身免疫病等。此外，糖蛋白糖链，还影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性及生物活性等。许多糖类相关的生物学过程都是潜在的药物治疗靶点，碳水化物特别是糖缀合物的研究对于新药研发具有重要意义，也因此日益被科学家和生物医药公司所重视。天然界中，参与糖缀合物、多糖生物合成的酶统称糖基转移酶。..之前，我们课题组融合了高通量基因克隆技术，无细胞蛋白表达技术，自组装单层糖芯片技术以及在线质谱分析技术，建立了一种高通量的糖基转移酶鉴定技术（Nature Chemical Biology. 2012, 8: 769-773)。课题实施过程中，我们进一步发展了该方法，并对一个物种或特定肿瘤细胞的N-糖基化蛋白在糖组学基础上进行了抓取和鉴定（J.Am.Chem.Soc.2016,138:11473-11476）。此方法不依赖于传统的糖结合蛋白（lectin），而是通过特定的糖基化修饰和点击化学反应进行N-糖蛋白的抓捕，并通过质谱分析进行鉴定。相比于传统的lectin亲和筛选，新发表的方法具有更好的特异性，操作更为简易，极大的提高了鉴定效率。同时我们也发展了O-GlcNAc修饰蛋白的基于组学的抓捕鉴定方法（ACS Chem. Biol. 2016, 11: 3002-3006）。..除了进一步扩充用于高通量糖基转移酶鉴定的糖芯片糖供体（大于31种糖核苷酸）和受体（约30种寡糖以及超过20中糖肽/蛋白），我们同时发展了N-糖蛋白/多肽的体外（in vitro）酶法制备技术。并对N-蛋白糖基转移酶进行了改造，扩充了其底物特异性（Chem. Commun.,2017, 53:9075-9077; J. Biol. Chem. 2017, 292: 8856-8863）。新的重要的糖基转移酶以及重要突变体的筛选鉴定均得益于我们开发的高通量糖基转移酶的鉴定方法。