谷氨酸棒杆菌Na+/H+逆向转运蛋白及其在压力应答中的机理研究

The Na+/H+ antiporters play crucial roles in cellular osmotic adjustment, the maintenance of intracellular pH homeostasis and dynamic balance of cellular Na+, and the regulation of cell volume, which are of great significance in extending our understanding of microbial diversities and its interrelationships with environmental factors. Therefore, further bioprospection and functional characterization of novel Na+/H+ antiporters will contribute to the elucidation of different environmental adaptation strategies, and provide new insights into industrial and agricultural biotechnology. Corynebacterium glutamicum is a Gram-positive soil bacterium with GRAS status, and widely used for industrial biotechnical fermentations, such as amino acids, nucleotides, organic acids and alcohols. Our previous studies demonstrated that C. glutamicum is a moderately alkali-tolerant as well as salt-tolerant organism, with optimal growth at pH 7.0-9.0. However, molecular mechanism underlying this physiological significance is unclear. In this study, we will focus on four C. glutamicum Na+/H+ antiporters, and elaborate their roles in ion transport, pH homeostasis, stress responses and metabolic flux by in vitro and in vivo methods. The elucidation of mechanisms by which C. glutamicum adapts to alkaline and salt environments as well as the regulation of stress responses, might provide new insights and strategies into metabolic engineering of this bacterium.

Na+/H+逆向转运蛋白在维持微生物胞内渗透压平衡、pH稳态、离子稳态以及调控细胞体积等方面发挥着重要作用，对于认识微生物多样性及其与环境的相互作用规律具有科学意义。对Na+/H+逆向转运蛋白基因资源的进一步挖掘和功能阐释，将有助于更好地认识不同微生物的环境适应策略，为其在农业或工业上的应用提供理论基础。谷氨酸棒杆菌作为一种食品安全级工业菌株，已被广泛用于生产各种氨基酸、核苷酸和有机酸等，具有重要经济价值。我们前期研究发现，谷氨酸棒杆菌具有一定的耐盐碱生理学特性，最适生长pH值在7.0-9.0，但是其分子机理尚不清楚。本项目拟通过体内和体外研究策略，明确谷氨酸棒杆菌四种不同类型Na+/H+逆向转运蛋白在离子转运、pH稳态、环境压力应答、中心碳代谢流分布等生理过程中的作用，分析并阐明谷氨酸棒杆菌应答盐碱胁迫等压力条件的生理适应机制，为工业上谷氨酸棒杆菌代谢性能的遗传改造提供新的思路和方法。

Na+/H+逆向转运蛋白在维持胞内渗透压平衡、pH稳态、离子稳态以及调控细胞体积等方面具有重要作用，对于认识微生物多样性及其与环境的相互作用具有重要意义。作为一种重要的传统工业微生物，谷氨酸棒杆菌被认为具有一定程度的盐碱胁迫耐受性。Na+/H+逆向转运蛋白作为细菌主要的钠泵系统, 在谷氨酸棒杆菌抗盐碱生理机制中作用尚不清晰？本项目拟通过体内和体外研究策略，明确谷氨酸棒杆菌不同类型Na+/H+逆向转运蛋白在离子转运、pH稳态、环境压力应答等生理过程中的作用，阐明谷氨酸棒杆菌应答盐碱胁迫等压力条件的生理适应机制。研究发现，谷氨酸棒杆菌中含有四种Na+/H+逆向转运蛋白（Mrp1、Mrp2、NhaP和ChaA）。体外互补实验表明，只有Mrp1蛋白能够有效补救大肠杆菌Na+/H+逆向转运蛋白缺陷菌株KNabc的生长缺陷。离子转运活性测定表明，Mrp1蛋白表现出最明显的碱性pH依赖性Na+(Li+)/H+ 反向离子转运活性，对Na+和Li+的底物亲和性分别为1.08 mM和1.41 mM。几乎所有转运蛋白都表现出一定程度的K+/H+ 反向离子转运活性，但是催化活性普遍较低。体内功能研究表明，谷氨酸棒杆菌Mrp1蛋白主要参与应答高NaCl和碱性胁迫，Mrp2蛋白主要参与应答高KCl胁迫，Mrp1和Mrp2同时存在，对于菌株在高盐碱条件下的正常存活都是必需的。谷氨酸棒杆菌Mrp1蛋白的缺失严重影响菌株胞内Na+离子和pH稳态，而mrp1和mrp2基因的同时缺失会使菌株胞内积累更多的毒性Na+离子，并表现出更碱性的胞内环境。基因表达分析发现，不同的胁迫条件会诱导不同Na+/H+逆向转运蛋白基因的表达，并且不同种类Na+/H+逆向转运蛋白间存在功能冗余和互补上调效应。通过定点突变分析，鉴定出谷氨酸棒杆菌Mrp1蛋白中多个氨基酸残基位点对于其活性功能的正常发挥具有重要作用，其中Mrp1A-K299位点可能是其发挥作用的关键残基之一。通过同源建模分析，发现谷氨酸棒杆菌Mrp1蛋白中的Mrp1A和Mrp1D亚基分别含有一个潜在的离子转运通道，K299位点可能是通过改变离子通道的结构或灵活度，从而影响Mrp1蛋白的活性。相关研究可以为代谢改造谷氨酸棒杆菌的耐盐碱胁迫生理性能提供理论基础。