一株中度嗜盐嗜碱菌Na+/H+逆向转运蛋白转运机制研究

The moderate halophilic and alkaliphilic Halomonas sp. 19-A, which had been isolated from alkaline black liquor in our previous work, is abundant in the black liquor and shows superior ability in black liquor treatment. The ion transport systems play important roles in the strain's tolerance to salinity and alkaliphily. There are four Na+/H+ antiporters predicated based on its genome. With the aid of analyses of transport activity and in transcriptal and expressional differences, the project aims to study the functions and transport mechanisms of these proteins, and elucidate the functions of these transports in the strain's adaption to extremely black liquor environment. Meanwhile, to analyze the evolutionary relationship and transport mechanism of the Mrp Na+/H+ antiporter system, which relative research is absent in the moderate halophilic alkaliphilc species. By constructing the single nonpolar mrp gene deletion mutant, detect their transport activities and examine the function of each subunit in the transport system; using 2D BN-PAGE and immunoblotting methods to determine the subunit's combination and the form of complex; using bioinformatics analysis to elucidate the evolutionary relationship of the Mrp transporter in different bacteria and to do some site-directed mutagenesis. The study is of great significance for elucidating the adaptive mechanism of strain 19-A in black liquor and revealing the functions and transport mechanisms of Na+/H+ antiporter (especially Mrp system) in the moderate halophilic alkaliphilic bacteria.

前期我们从强碱性造纸黑液分离到中度嗜盐嗜碱菌Halomonas sp. 19-A，优势存在于造纸黑液中且对造纸黑液具有突出的处理能力。该细菌对盐碱的耐受能力与其本身的离子转运性能直接相关。本项目拟通过转运活性测定、蛋白转录及表达水平差异分析等方法，对该菌基因组预测的4个Na+/H+逆向转运蛋白的转运功能进行分析比较，阐述Na+/H+转运蛋白在菌株应对极端环境中的作用；同时，对中度嗜盐嗜碱菌中缺乏相关研究的Mrp多亚基复合体进行进化及转运机制研究。通过双向Blue Native-PAGE、免疫印迹分析等检测复合体存在形式和各亚基结合形式，确定各亚基的功能作用；通过生物信息学方法研究Mrp系统在不同微生物之间的进化关系并进行定点突变。该研究对于阐述19-A菌株在造纸黑液中的生存机制、深入揭示Na+/H+逆向转运蛋白尤其是Mrp系统在中度嗜盐嗜碱微生物中的功能与作用机制具有重要的理论意义。

Halomonas sp. Y2(19-A)为一株分离自强碱高盐造纸黑液的耐盐嗜碱微生物。研究阐述其耐盐碱机制对于该菌株的应用具有重要意义。基于Na+(K+)/H+转运蛋白对菌株耐盐碱性的重要作用，本项目针对该菌株的Na+(K+)/H+转运蛋白进行系统研究。.首先，通过基因组测序和转录组分析，发现该蛋白具有发达的各类转运系统及系列相溶性溶质合成途径。其中无机离子的转运系统在转录组中表现为明显上调。对基因组注释的4个Na+/H+逆向转运蛋白序列进行转录水平分析及荧光定量PCR验证。进一步通过异源表达功能验证、反转膜活性测定、基因敲除等技术，确定四个蛋白在该菌株耐受不同盐碱环境时存在分工协作机制。该研究成果已发表在“Journal of Biological Chemistry”上（2016，291:26056-26065）.在分工协作机制中Mrp蛋白在Halomonas sp. Y2耐受高盐强碱环境中发挥重要作用。该蛋白复合体由七个亚基组成，在功能上存在协同作用且每个亚基在执行转运功能时必不可少。Mrp转运蛋白具有明显的Na+(Li+)转运活性，同时在碱性条件下表现出很强的K+外排功能，并且在Halomonas sp. Y2菌株耐受高钾压力中发挥关键作用。通过各类K+外排相关蛋白敲除、荧光定量PCR及原子吸收等技术，证明该菌株的K+外排作用具有明显的Na+依赖性且Mrp在其中发挥关键作用。另外，基于不同Mrp同源蛋白的多序列比对，找出系列相对保守位点进行定点突变及突变体转运功能活性测定，发现了一些与转运活性及离子特异性相关的重要位点。研究成果投稿至Journal of bacteriology，正在修回。.另外，Halomonas sp. Y2基因组中存在两个NhaD型同源蛋白且存在明显的转运活性差异。首先通过异源表达和定点突变阐述了两个蛋白的转运功能及关键位点。进一步研究发现N端截短后转运功能完全丧失，说明在结构中具有不可缺失的作用；通过系列嵌合体构建、荧光能量共振迁移技术（FRET）证明NhaD型蛋白的C、N端在C、N端在蛋白结构上距离较近且在转运活性上具有协同作用。相关研究成果发表在“Extremophiles” （2016, 20:631₋639）、“Journal of Bacteriology”上，（2017, 199:1₋11）上