NhaD型Na+/H+逆向转运蛋白的环境应答及分子转运机制分析

Na+/H+ antiporters play important even crucial roles in salt and alkali tolerance of organisms, and have great potentials in industry and agriculture. As the antiporter with high transport activity, research referring NhaD antiporters is limited, especially on its molecular transport mechanism. The project will focus on two NhaD type antiporters deriving from Halomonas strain, which possessing great difference in growth complementation and pH dependence of Na+ transporting. By using transmembrance structure predication and sequence alignment, various chimaeras and mutants will be constructed, and used for exploring important regions or sites referring environmental response, cation binding and pH sensitivity; In addition, roles of these important regions or sites will be confirmed by complementation experiments, by constructing various complementary strain from ΔnhaD1、ΔnhaD2 and testing their sensitivities upon salinity and alkali stress. In addition, important chimaeras and mutants will be constructed from other NhaD type antiportersof Halomonas elongata and Vibrio cholera. Based on this research, we will illustrate the molecular mechanisms of NhaD type proteins for environmental response and ion transporting.

Na+/H+逆向转运蛋白在生物体耐受高盐碱环境及工农业生产应用中具有重要作用和潜力。其中的NhaD型转运蛋白具有高的转运活性但相关研究较少，尤其是分子转运机制仅见少量定点突变研究报道。课题以来源于中度嗜盐嗜碱菌Halomonas的两个高活性NhaD型同源Na+/H+转运蛋白为研究对象，对NhaD蛋白的环境应答及分子转运机制进行深入研究。基于两个蛋白的生长互补及转运pH依赖性显著差异，通过跨膜结构预测和序列比对构建系列嵌合体和突变体，研究NhaD蛋白中与环境应答、离子结合及pH感应相关的关键区域与位点；利用基因回补技术对敲除菌株ΔnhaD1、ΔnhaD2进行各突变蛋白的回补表达，同时选择Halomonas elongata及Vibrio cholerae 来源的NhaD型蛋白进行嵌合体和突变体构建，验证关键区域和位点功能，最终系统阐述NhaD型蛋白的环境应答及分子转运机制。

首先经过系列表达体系和条件优化，获得了高纯度且具有一定产量的NhaD蛋白，为后期蛋白生化功能研究提供了基础。. 对Halomonas sp. Y2 NhaD 转运蛋白进行嵌合体构建及TM13转运功能研究。通过基于跨膜区的嵌合体构建，结合序列比对和二级结构预测，发现其中463-483区域可能是影响NhaD1和NhaD2功能差异的主要因素。对该区域两个蛋白的七个差异位点进行逐级替换，通过生长互补功能及转运活性实验确定突变体功能，进一步将部分突变体回补至敲除nhaD2基因的Y2菌株中，最终确定TM13螺旋为影响NhaD转运功能的关键区域。该部分研究成果发表在Frontiers in Microbiology上（Yang et al., 2018）. 通过进化保守性分析获得转运蛋白环境应答、离子结合及pH感应关键位点,筛选出20个高度保守的、具有底物结合及感应pH变化潜力的氨基酸，通过系列突变体构建及生长互补功能、转运活性测定及敲除互补实验，验证与环境感应、离子结合等功能相关的关键位点。通过FRET、胰蛋白酶水解实验，确定了关键功能位点突变体的构象变化。通过序列和结构分析，推测ChaA具有与NhaD类似的蛋白结构及转运机制，为确定本项目对NhaD关键区域和位点研究的准确性，对ChaA蛋白进行多序列比对与进化保守性分析，结果显示该蛋白具有两段高度保守区域。选择其中的16个保守位点（推测与NhaD位点和功能类似）进行突变，通过生长互补实验确定位点功能，获得了与NhaD蛋白类似的结果。综合研究结果构建了较精确的NhaD结构模型并系统阐述了其催化机制，该部分工作已投稿Journal of Biological Chemistry上。. 通过解析Halomonas sp. Y2基因组，发现其中存在四氢嘧啶合成代谢途径，且四氢嘧啶合成和外界环境渗透压力正相关Journal of biotechnology (Meng et al., 2018)；据此，通过分别敲除该菌中的Mrp、NhaD转运蛋白，构建能够在较低盐浓度培养基中发酵生产四氢嘧啶的工程菌株，这种通过敲除或弱化Na+/H+转运蛋白减弱菌种盐依赖性的思路，为依赖高盐发酵生产相容性溶质的工程菌构建提供了一种通用策略，该工作已发表在Microbial Cell Factories (Zhao et al., 2019)