Parkin介导的自噬在锰致神经毒性中的作用研究

Because of widely use in the steelmaking and anti-knock ,manganese concentration is rising in the environment.Over manganese exposure leads neural system damage mainly, but the mechanism is still unclear. Autophagy , Parkin involved in, keeps the cellular homeostasis by degrading the damaged organelle, excess or misfolded protein.Our former study found that PARK2 expression was decreased in the blood and saliva cells of the Mn-exposed subjects. Parkin level was decreased too in the corpus striatum of the Mn-exposure rats. Cells transfected with lentivirus PARK2 shRNA ( PARK2 knock down) aggravated the Mn-toxicity by cell culture. And promoted PARK2 expression alleviated the Mn-toxicity on dopaminergic neural cells.But the mechanism of parkin-mediated autophagy in the process of manganese-induced damage on neural cells needs further explore. Our study will explore the relationship between the cell damage(with over expressed or RNA interfered PARK2 in the Mn-exposure SK-N-SH cell) and the autophagy, and explore the Mn-induced neural toxicity ( by Parkin-mediated autophagy) on the mouse (with knock down PARK2) and rat. These research results could help us to understand the mechanism of parkin mediated autophagy on Mn-induced neural toxicity ,and supply the theory for finding the possible prevention interference target for the Mn-induced neural toxicity .

锰在炼钢、汽油抗暴剂中广泛使用，环境中锰浓度不断升高。接触锰过多主要导致中枢神经损害，但其损害机制尚不完全清楚。自噬通过自噬溶酶体选择性清除受损或多余细胞器、或错误折叠蛋白以维持细胞稳态，Parkin参与了自噬过程。我们前期研究发现：锰暴露人群血液和唾液中PARK2表达降低；染锰大鼠纹状体中PARK2表达产物Parkin降低；细胞试验证实抑制PARK2表达可增加锰对神经细胞毒作用；Parkin对多巴胺能神经细胞有保护作用。但Parkin如何介导自噬在锰致神经损害中的作用需进一步研究。本项目拟通过：1.用SK-N-SH细胞染锰，研究在PARK2过表达及RNA干扰状态下锰致神经细胞损伤与自噬之间的关系。2.用整体动物试验，观察染锰后Parkin介导的自噬在锰致神经毒性中的作用。通过上述研究，探索Parkin介导的自噬在锰致神经毒性效应中的作用机制，并为寻找可干预的锰神经毒作用靶点提供科学依据。

锰是人必需的微量元素，过量可造成神经系统的损伤。研究发现，锰暴露人群血液及唾液中PARK2基因表达降低，细胞实验中抑制PARK2基因表达可增加锰对神经细胞的毒性作用。本研究利用细胞及动物实验来探讨Parkin介导的自噬在锰致神经毒性中的作用。结果显示，（1）在细胞实验中，选择0、300、900 和1500μmol/L Mn2+对SK-N-SH细胞染毒24h，与对照组比较，随着锰浓度升高，细胞内自噬小体先增多后降低，线粒体形态改变，细胞凋亡率、ROS含量增加，线粒体膜电位、DA含量降低，PINK1和PARK2基因表达量降低，OPTN基因表达升高。（2）构建PARK2和OPTN基因过表达/敲低细胞模型，以900μmol/L Mn2+对各组细胞染毒24h,发现与空载组比较，PARK2过表达组细胞内 DA 含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值增加，ROS含量、P62和OPTN蛋白表达量降低；PARK2敲低组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值减少，ROS含量、P62 和OPTN蛋白表达量升高；OPTN过表达组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值增加，P62 蛋白表达量降低，Parkin 蛋白表达量不变；OPTN敲低组细胞内DA含量、LC3Ⅱ/Ⅰ值减少；P62 蛋白表达量升高，Parkin蛋白表达量不变。（3）整体动物实验发现，以0、12.5、25 和50 mg/Kg Mn2+对小鼠染毒4w，随着锰浓度升高小鼠运动及学习记忆能力降低，脑内DA含量降低，LC3Ⅱ/Ⅰ值先升高再减少；PINK1和PARK2基因表达量降低，OPTN基因表达升高。（4）建立PARK2基因敲除小鼠，用基因敲除小鼠和野生型C57B6小鼠分别设立对照组与锰处理组，锰处理组以50 mg/Kg Mn2+染毒4w，结果发现PARK2基因敲除后再染锰会加重锰造成的小鼠运动及学习记忆功能损伤以及DA分泌减少，同时会进一步降低小鼠脑内线粒体自噬水平。细胞实验结果表明锰在低剂量时会促进线粒体自噬，帮助维持细胞稳态功能。细胞及整体动物实验结果均表明高剂量锰暴露会抑制线粒体自噬，减少DA分泌；而PARK2基因敲低或敲除，导致线粒体自噬功能障碍，加重了锰的毒性效应。细胞实验中过表达PARK2基因可提高线粒体自噬水平，降低锰的毒性效应。提示锰抑制Parkin介导的线粒体自噬可能是锰致神经毒性的机制之一。本研究结果对进一步研究锰致神经毒性机制提供了新思路。