转录因子Klf5在成牙本质细胞分化中的作用机制

研究证明Klf5在多种细胞分化的转录调控网络中起关键作用。本项目组前期研究发现Klf5在小鼠分泌期成牙本质细胞中呈现高度特异性表达，而分泌期为成牙本质细胞终末分化的关键时期，推测Klf5可能在成牙本质细胞分化中起调控作用。本研究拟以成牙本质细胞分化的体外模型为研究对象，重点探讨：(1)观察Klf5在成牙本质细胞分化过程中的动态表达；（2）利用基因转染及RNAi技术，从过表达和抑制表达两个方面探讨Klf5对成牙本质细胞分化的影响，明确Klf5在成牙本质细胞分化中是否具有关键的调控作用；（3）利用芯片技术检测Klf5过表达或受抑制后下游基因表达情况，筛选受Klf5调控的下游靶基因，进一步利用生物信息学技术和凝胶迁移试验分析Klf5与下游靶基因的启动子序列是否结合，明确Klf5与下游靶基因启动子相结合的作用位点。本研究对进一步阐明成牙本质细胞分化的分子机制具有意义。

研究证明Klf5与多个关键靶基因结合而调控着多种细胞的分化或增殖。本项目组前期研究发现Klf5在小鼠分泌期成牙本质细胞中呈现高度特异性表达，而分泌期为成牙本质细胞终末分化的关键时期，推测Klf5在成牙本质细胞分化中起重要作用。本研究以小鼠牙乳头永生化细胞系（iMDP-3）分化的体外模型为研究对象，利用Real-time PCR和Western blotting，检测到Klf5协同成牙本质细胞分化标记物Dspp和Dmp1在成牙本质细胞样细胞分化过程中表达上调；利用免疫荧光技术，检测到Klf5和Dspp在小鼠磨牙的成釉细胞和成牙本质细胞，以及小鼠牙乳头永生化细胞的细胞浆和细胞核中共表达；利用基因转染技术，Klf5过表达可促进成牙本质细胞样细胞分化，并上调Dspp和Dmp1的表达；利用萤光素酶报告测试筛选出Klf5对Dspp转录调控的关键片段在Dspp上游启动子的5.6kb，对Dmp1转录调控的关键片段在Dmp1上游启动子的2.6kb；利用凝胶迁移试验（EMSA）和染色质免疫沉淀（CHIP）技术，检测到Klf5与Dspp上游启动子的5.6kb的几个结合位点以及与Dmp1上游启动子的2.6kb的数个结合位点均可结合。本研究表明Klf5可通过调控Dspp和Dmp1上游启动子的转录结合来促进成牙本质细胞样细胞的分化，为成牙本质细胞的分化机制提供理论基础。