一种新型甲壳素脱乙酰酶的脱乙酰模式研究

Chitin deacetylase (CDA), a key enzyme involved in the biosynthesis of fungal chitosan, can be potentially utilized in bioconversion of chitin to chitosan, to supersede the traditional way of chitosan production by hot-alkali. However, ascribed to our less understanding about the deacetylation mode of CDA, chitin is yet hard to be handled by CDA. Previously, we reported a CDA from Mortierella sp. DY-52, and the enzyme seemed to be a novel one and may have a novel deacetylation mode based on its biochemical properties and comparison with other reported CDAs. Therefore, in this research, we would like to illustrate its catalytic mechanism through enzyme reaction with chitin oligosaccharides and quantitative analysis of the end products. Ultimately, we would like to, at the molecular level, understand how this novel CDA recognizes and binds chitin and also how the reaction happens step by step, which is deemed to be also significant in clean production of chitosan.

甲壳素脱乙酰酶（CDA）是参与真菌细胞壁中壳聚糖生成的关键酶，它可以作为催化剂促成生物转化制备壳聚糖，一旦被规模放大，即有可能替代现行的热碱化学法，实现壳聚糖产业绿色转型，经济和生态意义重大。规模放大的瓶颈是CDA酶解效率低, 对CDA催化机理的研究较少，将其用于大规模生物转化的理论基础不足。申请者前期从Mortierella sp. DY-52中得到一种高活性CDA酶，初步的催化反应和结构分析表明该酶可能具有新型反应模式，对它的深入研究有可能为CDA酶的产业化应用提供重要依据。本申请拟通过上述CDA酶与模式底物几丁寡糖的反应，对所得复杂寡糖产物进行定性定量分析，结合酶动力学研究，尽可能确定CDA与不同聚合度几丁寡糖的结合位点和结合模式， 最终，在分子水平上阐明CDA与几丁寡糖的识别机理和反应模式，为提高CDA酶解效率，实现壳聚糖产业大规模绿色转型，提供理论基础和新颖途径。

甲壳素脱乙酰酶是参与真菌细胞壁及昆虫围食膜形成的一种关键酶。在产业上它可以作为催化剂促成生物转化制备壳聚糖，一旦被规模放大，即有可能替代现行的热碱化学法，实现壳聚糖产业的绿色转型，经济和生态意义重大。规模放大的瓶颈是该酶的催化效率较低，对脱乙酰酶的催化机理的研究较少，将其用于大规模生物转化的理论基础不足。.项目负责人在本项目前期工作中，从Mortierella sp. DY-52中得到一种高活性的甲壳素脱乙酰酶，初步的研究表明该酶可能具有新型的反应模式，对于它的深入研究有可能为甲壳素脱乙酰酶的产业化应用提供重要依据。.为了揭示该酶的反应模式这一关键科学问题，在本项目中，我们的研究内容主要包括以下几个方面：甲壳素脱乙酰酶的制备与纯化，复杂寡糖结构分析方法的构建，酶的反应动力学研究，酶对于不同聚合度几丁寡糖的脱乙酰模式研究，以及酶的生物学功能探索。.通过本研究，我们发现Mortierella sp. DY-52甲壳素脱乙酰酶只能与聚合度大于2的几丁寡糖或几丁质进行反应，而且其活性与聚合度的高低成正相关关系，此外，我们还发现该酶与几丁寡糖的反应符合Michalis-Menten plot, 其动力学米氏常数Km=1.1mM。该酶受到其酶反应副产物醋酸的抑制，抑制常数Ki=0.0277mM。.后续的研究表明，该酶对于几丁寡糖的催化反应采用的是一种外切型processive mode，而且起始于还原端。此种模式不同任何已报道的脱乙酰模式，具有重要的科学意义。该酶的存在可能与细胞壁的形成和细胞分化有关。