甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶抵御病毒侵染的分子机制研究

The peritrophic membrane(PM)is a chitin and glycoprotein layer lines the inbertebrate midgut，which has important roles in facilitating food digestion and providing protection to the midgut epithelium from pathogens infectious peros. Chitin deacetylase(CDA) is one of the major constituents of the PM proteins. This research is centered on the understanding of the biochemistry and molecular biology of one of the key insect pests in China-Spodoptera exigua (S.exigua) midgut CDA. Proteomics and genomics approach will be used to identify and characterize CDA from S.exigua larvae.The cDNA clones code for CDAs will be subjected to sequencing after restriction enzyme digestion analysis to exclude identical clones. The chitin-binding activity of CDAs will be analyzed using the chitin-binding assaying method. Recombinant baculoviruses will be constructed using the Bac-to-Bac system to over-express and analyze the temporal expression of CDAs. Combined transcriptome sequencing with gene expression profile, the downregulation of CDA after pathogen(virus) infection is hypothesized that this protein might be responsible for the homeostasis of the PM structure. The insect may reduce PM permeability by reduction of CDA expression, as a result, decreasing the entrance of baculovirus. These will support the downregulation of CDA as a possible mechanism used by S.exigua to reduce susceptibility to baculovirus by decreasing PM permeability. The mechanism that CDA is the target substrate for baculovirus will be used to explore novel bioagents for pest control.

昆虫中肠表面覆盖有无脊椎动物所特有的几丁质-蛋白质的复合结构，围食膜（peritrophic membrane,PM），具有保护中肠免受病毒等微生物侵染等功能，几丁质脱乙酰酶（chitin deacetylase,CDA）是昆虫PM的重要蛋白组分。本项目以农业上重要害虫甜菜夜蛾为研究对象，利用ITRAQ等蛋白质组学方法，结合前期得到的甜菜夜蛾中肠cDNA表达文库ESTs，进行CDA蛋白的分离鉴定及其cDNA基因克隆；利用生物信息学分析其序列结构特性，进行组织特异性表达和生化特性分析；结合转录组测序和表达谱分析，明确病毒侵染后CDA的表达变化，分析病毒侵染后PM通透性的变化，以论证中肠特异性表达的CDA蛋白在病毒侵染后的下调导致围食膜通透性下降而降低了甜菜夜蛾对病毒的敏感性的这一分子机制假说，即CDA蛋白为生防因子病毒的作用靶标，探寻以环境友好型的新手段防治和控制甜菜夜蛾危害。

本项目以农业上重要害虫甜菜夜蛾为研究对象，进行了几丁质脱乙酰酶（CDA）的分离鉴定及功能分析。通过分析甜菜夜蛾中肠转录组数据库并结合NCBI已提交的昆虫cdas基因序列，获得6个编码甜菜夜蛾几丁质脱乙酰酶的基因secda 1/2/4/5/6/7（登录号分别为KJ621414、MG544853、MK518373、KR363154、MG604928和MG604929），开放阅读框分别为1659 bp、1611 bp、1497bp、1152bp、1164bp 和1134bp；生物信息学分析发现SeCDA1和SeCDA2包含几丁质结合区（ChBD）、低密度脂蛋白受体区（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化区（CDA），属于Group I类CDA蛋白，SeCDA4含有几丁质结合区（ChBD）和几丁质脱乙酰基催化区（CDA），属于Group III类CDA蛋白，SeCDA5、SeCDA6和SeCDA7仅包含几丁质脱乙酰基催化区（CDA）属于GroupⅤ类CDA蛋白；secdas基因分别在大肠杆菌和昆虫细胞中成功表达分子量为63 kDa、61 kDa、56 kDa 、43 kDa 、44kDa和43 kDa的CDA蛋白；生化特性分析表明SeCDA1和SeCDA2蛋白具有脱乙酰基酶活性，而GroupⅤ类的SeCDA5、SeCDA6和SeCDA7蛋白具有较强的几丁质结合活性无脱乙酰基酶活性；组织定位研究表明secda1和secda2在幼虫表皮中高表达，secda 4在预蛹期表达量较高，而secda5/6/7属于中肠特异表达蛋白；实时定量分析显示SeNPV病毒侵染后对secda2和secda5基因表达呈现先降低再升高的变化趋势；RNAi研究结果发现注射dsRNA- secda5/-secda6/-secda7后甜菜夜蛾幼虫正常生长无明显表型变化，注射dssecda2后幼虫表现为生长缓慢，动作迟缓，少动，幼虫蜕皮异常最终死亡。SeCDA在甜菜夜蛾生长发育中起重要作用，病毒侵染可引起幼虫敏感性降低，本研究为害虫生物防治提供新靶标控制甜菜夜蛾危害。