大鼠冷应激相关miRNA及蛋白质的筛选鉴定及功能分析

Stress makes animal husbandry cause great loss attracted public attention, studies on the mechanism of how animals stress happen have important theoretical significance to animal husbandry. In recent years, domestic scholars gradually started to attach importance to the stress of animal research. In our previous work, HSP70 could protect the animals from the cold , and can be used as index of evaluating cold stress degree. Although significant results were achieved in cold stress research, but occurring and molecular regulation mechanism of cold stress have not gained substantial progress. The major research emphasis on the cold stress home and abroad mainly focus on the roles of single or Several molecular, but are deficient in the systemic integrated research on the level of gene and protein, which brought the difficulty to determine molecular markers and mechanism of stress. Therefore, this study intends to construct differential miRNAs and protein expressed at different stages in serum from model rats before and after cold stress, and which will be analyzed by bioinformatics methods in order to predict miRNA -protein molecular network, and then analyze and test the relation of target miRNA-mRNA and , miRNA-protein, explore the roles the target miRNAs and protein in cold stress, obtain a single candidate cold stress diagnostic markers or diagnostic markers combination of cold stress,define the key control point of stress in order to lay the theoretical foundation for the molecular mechanisms of stress and supply scientific evidence for stress-related disorders of animals and human.

应激引起畜牧业的巨大损失备受关注，研究畜禽应激的发生机制对畜牧业发展具有重要意义。近年国内学者逐渐开始重视动物应激的研究。申请者在前期工作中，发现热休克蛋白70不仅对动物冷应激有保护作用，还可能作为评估应激的重要标志物。目前国内外对应激发生机制的研究，往往强调单个或少数几个分子在应激的作用，缺乏在基因与蛋白质水平的系统性研究，从而难以准确地评估应激状态及探索应激发生机制。因此本研究拟构建冷应激前后大鼠血清miRNA与蛋白质差异表达谱，应用生物信息学技术，结合比较蛋白组学数据，选择冷应激相关目标miRNAs和蛋白质，采用基因沉默与过表达技术，对目标miRNA进行靶基因与靶蛋白功能验证，揭示目标miRNA和蛋白质在冷应激发生中的调控作用，获得单一候选冷应激诊断标志物或诊断标志物组合，明确冷应激反应关键控制点，为深入研究冷应激发生的分子机制奠定理论基础，进而为动物与人类应激疾病防治提供科学依据。

低温是寒区最主要的非生物性应激原之一，由此导致的冷应激严重影响畜禽的生长、发育、免疫、生产和繁殖性能，甚至引起猝死。由低温引起的动物冷应激给寒区畜牧业造成巨大经济损失，是制约北方畜牧业发展的主要因素之一。开展冷应激研究的首要问题是如何客观、准确地评价动物机体的应激状态。因此，本项目通过基因组学和比较蛋白质组学等方法，开展动物冷应激发生机制的研究。.本项目成功构建了大鼠冷应激动物模型，该模型的构建为后续大鼠及其他动物冷应激发生机制的研究提供了重要的参考数据。通过冷应激大鼠血浆中蛋白质差异表达谱、大鼠血清中miRNA差异表达谱的成功构建，筛选并获得了候选的冷应激血液诊断标志物组织相容性蛋白HA-1、Ras相关蛋白Rap1b、整合蛋白β-1、miR-151-3p、miR-92a-3p、miR-425-5p、miR-210-3p、miR-98-5p、miR-328a-3p和miR-383-5p。.本项目针对目标蛋白Rap1b进行了功能研究，研究发现其在应激发生过程中可发挥分子开关作用，且Rap1b可对大鼠肝细胞氧化应激起到抑制凋亡与缓解应激反应的保护作用，而这一作用的发挥是通过其作用于效应因子B-raf，激活ERK通路所实现的。在对目标miRNA的功能研究中发现，miR-383-5p在大鼠肝脏细胞中下调表达，可显著促进细胞增殖、能量代谢、促进Mtor和Apbb3的转录，Pfkfb1的转录和翻译；miR-210-3p在大鼠肝脏细胞中上调表达，可对冷应激大鼠肝脏造成一定损伤，尤其是影响大鼠肝细胞的增殖和凋亡；降低大鼠的免疫力；并抑制大鼠肝脏中的呼吸链电子传递；同时也减少了大鼠肝脏在过度动员时产生的氧化损伤。这些研究成果均将为深入研究冷应激发生的分子机制奠定理论基础，为临床医学、军事医学、特殊环境生理学领域的相关研究提供重要参考。.本项目公开发表科研论文14篇，其中SCI论文2篇，国家级核心期刊论文11篇，核心期刊论文1篇；培养博士研究生1名，硕士研究生4名，目前仍有2名硕士在读。