食品有害物苯并(a)芘通过介导FOXO4磷酸化诱导肝细胞自噬性损伤的机制研究

Benzo-a-pyrene (BaP) is produced in the smoking, frying, grilling and toasting process during food production as a typical pollutant. Study on the cytotoxicity mechanisms of BaP on body could provide scientific evidence for toxicity intervention and food safety control system building. Previously researches have shown that BaP caused body tissue damage by inducing autophagy, however, the mechanism is still very rare.The forkhead box transcription factor FOXO proteins are regulatory switch for many gene transcription with a key player in cell autophagy, but the action mechanism of family member FOXO4 in autophagy is unclear. This project plans to focus on BaP and human normal liver HL7702 cells. Using cell autophagy inhibitor and activator, phosphorylation inhibitor and activator, FOXO4 siRNA, and dual luciferase reporter gene to examine the number and form of autophagosome, the phosphorylation and promoter activity of FOXO4, and the levels of autophagy-related proteins and genes. This project also analyzes the role of BaP on FOXO4 transcriptional activity, and the effect of FOXO4 on the transcription of autophagy-related proteins. Furthermore, this study attempts to explore the molecular mechanism of BaP in inducing autophagy in HL-7702 cells via mediating the phosphorylation and transcriptional activity of FOXO4, which may contribute to new clues for the reveal of cytotoxicity mechanisms and targeted intervention.

苯并(a)芘（BaP）是食品熏、炸、烧、烤等加工过程中产生的典型有害物。研究BaP对机体的损害机制可为其毒性干预和食品安全控制体系构建提供科学依据。近期研究表明，BaP可通过诱发细胞自噬损伤机体组织，但相关作用机制鲜有报道。叉头转录因子FOXO是调控许多基因转录的开关，在细胞自噬中起核心作用，但其家族成员FOXO4对自噬的作用尚不十分清楚。本项目拟以BaP作用HL-7702人肝细胞为研究对象，以FOXO4为靶点，通过采用自噬抑制剂和激活剂、磷酸化抑制剂和激活剂、FOXO4小RNA干扰、双荧光素酶报告基因等手段检测自噬泡数量和形态、FOXO4磷酸化和启动子活性、自噬特征蛋白和基因等，分析BaP对FOXO4转录活性及FOXO4对自噬特征蛋白的影响，阐明BaP通过介导FOXO4磷酸化调节其转录活性继而诱导细胞自噬的分子机制。研究结果为揭示食品有害物BaP的自噬性毒性机制及危害干预提供新线索。

苯并(a)芘（BaP）是食品熏、炸、烧、烤等加工过程中产生的典型有害物，严重威胁人体健康。据报道，BaP可通过诱发细胞自噬损伤机体组织，但相关作用机制鲜有报道。本项目以BaP为研究对象，以FOXO4为靶点，通过采用自噬抑制剂、磷酸化抑制剂和激活剂、荧光标记、透射电子显微镜等手段检测自噬泡数量和形态、FOXO4磷酸化、自噬特征蛋白等，分析BaP对FOXO4及其磷酸化对自噬特征蛋白的影响，揭示BaP通过介导FOXO4磷酸化诱导肝细胞自噬性损伤的毒性机制。体外研究发现，5μM、25μM、50μM 的BaP均可通过增加自噬泡数量、上调自噬特征蛋白Beclin-1和LC3-II表达来诱发HL-7702人肝细胞自噬性损伤，降低细胞活力，且损伤效果存在剂量依赖性，即BaP浓度越高，自噬性损伤程度越严重；同时，体内研究也进一步证实，50 mg/kg·bw 的BaP可显著（p < 0.05）导致BALB/c雄性小鼠肝脏组织发生自噬性损伤，表现为自噬泡数量增加、自噬特征指标Beclin-1（上调率38.1 %）和LC3-II（上调率21.9 %）基因高表达。此外，通过运用FOXO4磷酸化抑制剂LY-294002和激活剂IGF-1，发现BaP可上调FOXO4蛋白表达，下调p-FOXO4蛋白表达和p-FOXO4与FOXO4比值（下调率11.5%），即增强FOXO4转录活性。LY-294002可显著（p < 0.05）增强BaP诱导的肝细胞内自噬泡数量及自噬特征蛋白Beclin-1（上调率2.9%）和LC3-II（上调率40.0%）的增加；反之，IGF-1可阻碍BaP诱导的细胞自噬性损伤。研究结果表明，BaP可通过抑制FOXO4磷酸化，增强其转录活性，继而上调自噬特征指标Beclin-1和LC3-II水平，增加自噬泡数量，最终导致肝细胞自噬性损伤。研究结果为揭示食品有害物BaP的自噬性毒性机制及其危害干预和食品安全控制体系构建提供新线索。