Centlein蛋白新亚型参与网格蛋白介导的内吞作用和囊泡运输的分子机制

Our previous study revealed that centlein was required for microtubule nucleation and anchoring at centrosomes, while centlein required KIFC3 for its centrosomal localization. The microtubule minus-end directed motor KIFC3 interacted with both centlein and the dynactin's largest subunit p150Glued. .Recently, we have unexpectedly found that a new monoclonal anti-centlein antibody displayed a punctate pattern in cultured human cells, which was diminished following siRNA centlein treatment. The authenticity of the centlein punctum was thus verified. The punctate vesicular-like pattern represented a novel protein isoform because overexpression of the isoform showed a punctate staining similar to that labeled by the monoclonal antibody. The novel protein isoform is composed of 1410 amino acids, named centlein(1410aa). We further found that the centlein(1410aa) punctum partially colocalized with markers of endocytosis AP2 and clathrin, and the early endosomal marker EEA1, of which all were co-immunoprecipitated with centlein(1410aa), respectively..The proposal described here aims to address （1）how centlein(1410aa) is involved in clathrin-mediated endocytosis; （2）how the KIFC3/dynactin mediates the centlein-containing vesicle transport. To this end, we are able to propose a model for cenltein in clathrin-mediated endocytosis, endosomal motility and vesicle transport driven by KIFC3/dynactin complex toward the minus end of the microtubule.

我们已经证明centlein为微管成核和锚定在细胞中心体所必需，且centlein在细胞中心体的定位取决于微管负端导向驱动蛋白KIFC3。KIFC3既结合centlein又与dynactin最大亚基p150Glued相互作用。我们最近分离得到一个centlein蛋白新亚型，含有1410个氨基酸，故命名为centlein(1410aa)。该亚型在细胞中呈点状分布，且部分与内吞作用的标记蛋白clathrin、AP2和早期胞内体标记蛋白EEA1共定位。进一步实验证实centlein(1410aa)分别与clathrin、AP2、EEA1免疫共沉淀。本申请旨在阐明（1）Centlein(1410aa)如何参与clathrin介导的内吞作用；（2）KIFC3/dynactin复合体如何通过centlein调控囊泡运输。最终提出KIFC3/dynactin复合体驱动细胞内囊泡朝微管负端运输的新模式。

本实验室前期研究发现Centlein蛋白定位于细胞内吞系统中的囊泡上，而且通过组分分离发现，Centlein主要分布于细胞的膜成分中且属于外在膜蛋白。结合生物信息学的预测结果我们推断Centlein可能是一种与内吞作用或囊泡活动相关的蛋白，参与调节囊泡的生物学活动。因此我们于2012年申请并得到名为“Centlein蛋白新亚型参与网格蛋白介导的内吞作用和囊泡运输的分子机制”的自然科学基金面上项目。.我们首先在哺乳动物细胞体系中表达纯化得到Centlein纯蛋白，分析研究其生化特性，发现Centlein蛋白直接与质膜结合并具有囊泡栓链因子（Tethering factor）的作用，可以把囊泡连接在一起使它们靠近接触，促进其融合。.我们使用Crispr-Cas9技术在hTERT-RPE1细胞中敲除Centlein观察表型，发现初级内含体的形成和成熟受到抑制，结合Centlein囊泡栓链因子特性，发现Centlein通过发挥囊泡栓链因子作用促进从细胞膜内吞至初级内含体的小囊泡与初级内含体融合，进而促进初级内含体变大成熟。我们还发现敲除Centlein，细胞中原生纤毛的形成受到了明显的抑制，进一步研究发现Centlein定位于纤毛和纤毛囊泡上，且与纤毛形成时重要的GTP转换蛋白Rabin8结合。在纤毛形成初期Centlein与Rabin8结合并被Rabin8囊泡运输到纤毛囊泡处，Centlein通过发挥囊泡栓链因子的作用将Rabin8囊泡与纤毛囊泡连接在一起，促进它们靠近和接触，进而融合到纤毛囊泡上。.以上研究基本已完成，正在撰写文章阶段，所有内容将撰写成两篇文章分别是：“Centlein发挥囊泡栓链因子作用调控细胞内吞活动和初级内含体融合”和“Centlein发挥囊泡栓链因子作用促进纤毛囊泡融合进而调控纤毛形成”。.本研究定义了一种新的囊泡栓链因子Centlein，并阐述了其发挥作用的分子机制，扩展了对内吞系统中的小囊泡融合的认识。本课题组还第一次报道促进纤毛囊泡融合的囊泡栓链因子，并阐述了其发挥作用的分子机制。填补原生纤毛形成初期的研究空白。.在研究Centlein的过程中我们还得到一些相关的发现，对其进行研究取得一定进展，部分研究结果已经发表，共发表2篇SCI文章，均以本自然科学基金（批准号为31271522）作为第一标注。我们十分感谢自然科学基金面上项目支持。