苯并（a）芘对热休克蛋白90介导的肺癌细胞自噬的分子机理探讨

As an important signal transducer, heat shock protein 90（HSP90）can mediate the process of autophagy. Existing researches have indicated that Benzo(a)pyrene (BaP) is one of the major environmental carcinogens. In addition, tumorigenesis relates closely with autophagy. However, the relationship between BaP and autophagy or the role of HSP90 in autophagy induced by BaP have not been reported yet. RT-PCR、Western blot, comet assay，siRNA interference，xenograft assay etc will be used in this project to study whether BaP influences autophagy through the following three approaches: 1. HSP90 mediates autophagy with up-regulated HIF-1 expression by AhR signaling pathway activation after BaP treatment. 2.The metabolites of BaP induce gene instability as it can bind with DNA double strand and then mediate autophagy via HSP90. 3. Once BaP combines with AhR，HSP90 will separate from AhR and be released to cytoplasm，which further influences autophagy. The molecular mechanism of BaP on HSP90 mediated autophagy will be clarified by the above experiments. This will lay a foundation for studies about carcinogenic mechanisms of BaP and prospect of HSP90 as a target for anti-cancer drugs.

分子伴侣热休克蛋白90（HSP90）是重要的信号转导因子，可介导细胞自噬。已有研究表明：苯并（a）芘（BaP）是重要的环境致癌物之一；肿瘤的发生发展与自噬密切相关。但BaP与自噬的关系及HSP90在BaP引起自噬之间的作用尚未见文献报道，本课题拟采用RT-PCR、Western blot、彗星实验、siRNA干扰、裸鼠皮下成瘤实验等技术探讨BaP是否通过以下三个途径影响自噬：1.BaP激活AhR信号通路，使HIF-1表达增加并通过HSP90调节自噬；2.BaP的代谢产物与DNA双链结合引起基因组的不稳定性，通过HSP90介导自噬；3.Bap与AhR结合时，HSP90与AhR分离释放到胞浆进一步影响自噬。通过以上研究明确HSP90在BaP诱导自噬中的分子机理，为BaP致癌机理的研究和HSP90作为抗癌药物的靶标研究奠定一定的基础。

本项目（1）采用qPCR，Western blot和免疫荧光法研究BaP激活AhR信号通路并通过HSP90调节自噬。结果显示：缺氧环境（300μM CoCl2）可以诱导HIF-1、HSP90、HSC70和LAMP-2A的表达，而加入1μM BaP后可以抑制各基因和蛋白的表达。说明在缺氧环境下，BaP可以抑制CMA。而在常氧环境下，BaP可能造成A549细胞内缺氧，影响CMA相关基因和蛋白表达。在常氧和缺氧环境下，加入HSP90抑制剂后，HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A基因和蛋白的表达降低，表明BaP抑制CMA与HSP90有关。（2）采用彗星实验和γ-H2AX方法研究BaP的代谢产物与DNA双链结合引起基因组的不稳定性，从而影响CMA。结果显示：BaP可能通过引起细胞内DNA双链断裂进而调控CMA。（3）采用shRNA、qPCR和Western blot法研究在常氧和缺氧环境下BaP对沉默HSP90的A549细胞自噬的影响。结果显示：在常氧环境下BaP可能通过HSP90调节LAMP-2A，从而影响CMA。在缺氧环境下BaP抑制CMA与HSP90有关，沉默A549细胞中HSP90增加BaP抑制CMA 的作用。（4）构建A549细胞系HSP90低表达裸鼠皮下成瘤动物模型，qPCR，Western blot和免疫组化法研究HSP90在BaP调控的CMA中的作用。结果显示：BaP能促进人肺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长，沉默HSP90后，裸鼠移植瘤的生长被抑制；在整体动物水平上，BaP可以促进CMA相关基因的表达。（5）采用CCK-8和Transwell法研究BaP对沉默HSP90的A549细胞增殖、迁移和侵袭力的影响。结果表明：沉默HSP90抑制了BaP促进A549细胞增殖、迁移和侵袭力的作用。（6）采用HE染色，qPCR，Western blot和免疫组化法研究BaP对C57BL小鼠肺组织及CMA相关基因表达的影响。结果表明：BaP对C57BL小鼠肺组织造成损伤，上调C57BL小鼠肺组织内CMA相关基因的mRNA和蛋白表达。说明BaP可能通过活化CMA对C57BL小鼠肺组织造成损伤。通过以上研究明确HSP90在BaP诱导自噬中的分子机理，为BaP致癌机理的研究和HSP90作为抗癌药物的靶标研究奠定一定的基础。