APOBEC3G在温热诱导抗HPV感染中的作用及机制研究

Local hyperthermia has been successfully used in the treatment of human papilomavirus-infected skin lesions, but the mechanism is not clear. During thermotherapy, patients with multiple lesions tended to experience clearance of all the lesions, once the targeted lesion responded, suggesting that local hyperthermia aided in the establishment of specific immune response against HPV infected skin. Our previous study revealed that the clinical responders possessed more expression of APOBEC3G and more mutations than those non-responders to hyperthermia treatment, indicating that APOBEC3G was involved to regulate the immunity response against HPV. This research aims to explore the effect of local hyperthermia on the expression of APOBEC3G and its subsequent editing effect on HPV early genes and enhancement of immunogenicity required for the activation of CTL, using thermo-treated clinical wart tissues in vivo, and HPV transfected cell lines in vitro, thus elucidating the immunologic mechanism of local hyperthermia to treat against HPV infected diseases.

温热疗法对人乳头瘤病毒（HPV）感染皮肤病有确切疗效，但对于治疗机理尚不明确。治疗过程中发现，对多发疣体患者，治疗一处靶疣常伴有远隔非治疗部位疣体消退，提示温热可能通过诱导机体免疫发挥抗病毒作用。治疗高反应者皮损中APOBEC3G表达水平及HPVE2碱基突变率明显高于治疗低反应患者。我们推测温热可能通过提高皮损处APOBEC3G的表达，增加HPV基因突变，诱导机体产生针对HPV的有效免疫。本研究拟以体内、体外温热干预疣体组织及整合HPV细胞系为研究对象，观察APOBEC3G在温热诱导下对皮肤中病毒序列的编辑作用，进而改变HPV免疫原性，增强细胞毒性T细胞的抗原识别和杀伤功能，进而寻找干预增强机体抗病毒免疫作用的关键靶点，深入认识温热诱导抗病毒免疫机制，为局部温热疗法治疗HPV感染相关疾病提供理论依据。

本项目紧密围绕受温热影响显著高表达的APOBEC3G分子，并将这一内容进行扩展，发现HO-1以及IRF-1在抗病毒以及提高细胞杀伤功能中同样发挥重要作用。在分子生物学方面完成大量工作①本研究采用慢病毒转染方式构建APOBEC3G过表达的CaSki细胞系和SiHa细胞系，作为主要研究对象。②在SiHa细胞系和CaSki细胞系中，采用Real-time PCR以及3D-PCR技术，检测到APOBEC3G对HPV基因的编辑作用以及能够降低HPV病毒拷贝数。③项目组根据HPV16E2蛋白全长氨基酸序列（NCBI 29468136）分析，从E2蛋白第一位氨基酸残基开始，截取九肽和十肽，通过标准系数计算每一条肽段与HLA-A*0201的结合系数，选取其中二条结合系数最高的肽段作为CTL表位。根据APOBEC3G引起HPV突变的规律，将肽段突变后，发现CTL数量增多，杀伤作用增强。④项目组反复验证温热对高危型HPV的清除概率以及在高危型HPV感染中温热对APOBEC3G表达的影响，证实了温热可以有效清除宫颈高危型HPV，且可引起APOBEC3G表达增加。⑤ 44℃温热刺激联合HO-1基因缺失可造成凋亡抑制蛋白XIAP下降，并促进细胞自噬水平增加，降低了细胞对44℃温热刺激的抵抗力，G1期比例增加，MTS增殖减弱，病毒拷贝数降低，提升了细胞的抗病毒分子活性。⑥温热可以通过lncRNA影响HaCaT细胞凋亡与增殖变化，以及影响下游转录因子IRF-1的表达，在组织以及细胞中得到证实。该结果有助于进一步扩展温热治疗的机制研究。以上结果提示，温热诱导的APOBEC3G表达以及联合HO-1敲除对感染性疾病通路，尤其是病毒感染、抗原提成等相关通路有着一定的影响，提示我们温热治疗HPV感染有效性的免疫学机制。这些重要数据对我们未来研究重点奠定了基础。