克氏原螯虾精氨酸激酶的抗原表位与抗体相互作用的研究

Procambarus clarkii have served as an important freshwater aquaculture resource in China. In our previously research, arginine kinase (AK) was identified as a major allergen of shellfish, property analysis of AK revealed AK may cause cross-reactivity among invertebrates. Meanwhile, the molecular structure of AK has an important influence on its allergenicity. The epitope mapping and structure analysis of AK is crucial for the allergenicity determination. the epiotpe of AK in freshwater shellfish has not been described yet, and the cross-reactivity and structure-activity relationship is also unclear. In this project, AK specific nanobody will be prepared, and the crystal structure of P. clarkii AK will be determined for the epitope mapping; the analysis of allergen-antibody interaction will be carried out to verify the mechanism of the structure-activity relationship of AK. Furthermore, high affinity epitope specific nanobody will be screened, for the establishment of a detection method based on the epitope specific nanobody. From the above, the molecular mechanism and structural basic of the cross-reactivity of AK will be clearified, meanwhile, the allergenicity and structure-activity relationship of AK will be fully illustrated. We believe the results of this program are helpful to complete the fundamental research of shellfish allergens, as well as to establish the basis for the allergen detection and hypoallergenic food development.

克氏原螯虾是我国重要的淡水甲壳类水产品，其引发的食物过敏病例屡见不鲜。申请人前期研究发现，精氨酸激酶（arginine kinase，AK）是甲壳类水产品主要过敏原，也是引起免疫交叉反应的潜在过敏原，且其致敏性强弱与空间结构的变化存在密切关联，因此AK的抗原表位鉴定和结构特征分析是揭示其致敏机理的关键。但淡水甲壳类水产品AK的抗原表位研究少见报道，免疫交叉反应性及构效关系的研究也不深入。本项目以克氏原螯虾为研究对象，针对AK制备特异性纳米抗体，解析AK的晶体结构，完成AK的抗原表位分析；明确AK与特纳米抗体的相互作用位点，揭示抗原-抗体相互作用随AK结构改变的规律；从制备的纳米抗体中筛选高亲和力的表位特异性纳米抗体，创建AK的纳米抗体精准检测方法。本项目旨在阐明AK致敏性的分子机理和结构基础，完善甲壳类水产品AK的过敏原性研究，为甲壳类食品过敏原的检测和改性研究提供理论依据。

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）是我国重要的淡水甲壳类水产品，其引发的食物过敏病例屡见不鲜。精氨酸激酶（arginine kinase，AK）是甲壳类水产品主要过敏原，但淡水甲壳类水产品AK的表位、免疫交叉反应性及构效关系研究少见报道。本研究通过X射线衍射解析了分辨率为1.5 Å的克氏原螯虾AK晶体结构，结构的比对分析表明无脊椎动物中的致敏AK具有保守的分子结构；AK与其同家族脊椎动物过敏原肌酸激酶的也具有相似的空间结构，结构的相似性为AK的免疫交叉反应提供了分子基础。以克氏原螯虾AK为抗原免疫条纹斑竹鲨（Chiloscyllium plagiosum）后从其白细胞中克隆获得鲨源抗体的全套可变区基因。将可变区基因片段与M13噬菌体衣壳蛋白编码基因相连接构建了～107 CFU的纳米抗体噬菌体展示文库，并从中筛选到3个AK特异性鲨源纳米抗体序列。以改造的PTT5（PTT5-Tev-Fc）为表达载体，利用人胚肾293F细胞真核表达系统获得了携带抗体可结晶片段的重组纳米抗体VNAR-11、VNAR-65和VNAR-95。以重组纳米抗体为靶蛋白，通过对噬菌体展示随机十二肽库的亲和淘选结合生物信息学技术，将抗体与AK的相互作用位点定位于AK晶体结构中，亲和力检测结果表明VNAR-65和VNAR-95与AK的亲和力KD可达～10-7 M。热处理和变性剂处理前后AK与重组纳米抗体结合活性的比较发现重组纳米抗体对空间结构变化的AK都具有较好的检测活性，但不同处理方式对AK结构和免疫结合活性的影响不同：热处理主要引起AK分子间的聚合导致构象表位的掩盖；变性剂处理则通过破坏AK分子内二硫键造成的空间结构改变影响抗体结合位点的微环境。综上，本研究完成了克氏原螯虾AK的晶体结构解析，为抗原-抗体相互作用位点分析提供了精确模板，同时明确了AK免疫交叉反应性的分子基础。构建了鲨源纳米抗体噬菌体展示文库，通过对该抗体文库的筛选及阳性克隆的真核表达，完成了AK特异性重组纳米抗体的制备和抗原-抗体相互作用位点及亲和力分析。通过比较加工处理前后AK与重组纳米抗体的亲和力变化，解明了AK的构效关系，证实VNAR-65和VNAR-95可用于甲壳类水产品及其加工制品的检测。这些结果可为全面、深入的甲壳类水产品过敏原研究奠定基础，也可为甲壳类水产食品过敏原的检测提供依据。