温热上调DNAJA4影响M2-PK诱导抗HPV病毒感染免疫机制

Local hyperthermia to treat cutaneous human papilloma virus infection using thermotherapeutic device with independent intellectual property rights has been eutherapeutic during clinical application. During thermotherapy, the non-targeted, distal cutaneous lesions were cured as well as directly targeted lesion, prompting an underlying systemic immunological antiviral responding mechanism of the body, which remains to be further investigated. Our data shows that thermo-treatment changed the expression pattern of a HSP40 family member, DnaJA4, and thus further influenced a series of other immune-active components, like MHC-I and CD8+ CTL. This research concentrates on DnaJA4 to explore the protein-protein interaction, conformational and isoformal change of M2-PK through HPV-E7 interaction, and intracellular antigen- MHC-I complex formation which activate CD8+ thymocytes by using human keratinocytes, HPV transfected cell lines and thermo-treated clinical wart tissues. Furthermore, the research aims to define the interaction between key molecules and search for immunologic targets for artificial intervention, and bring further understandings into the mechanism of anti-viral immunity induced by local hyperthermia.

自主知识产权的局部温热疗法治疗人乳头瘤病毒感染性皮肤病观察到良好临床疗效，治疗一处靶疣使得远隔非干预部位的其他疣体也会脱落，提示温热可诱导机体产生抗病毒的系统性免疫，但具体免疫诱导机制不明。前期数据显示HSP40家族DNAJA4在温热过程中发生明确改变，该基因可以影响到一系列涉及MHC I、CD8+T细胞免疫的相关分子表达。本研究拟以角质形成细胞、HPV基因整合细胞系、温热干预的疣体组织为研究对象，以DNAJA4为核心，研究DNAJA4所结合的相互作用蛋白、温热通过DNAJA4影响与HPV早期蛋白E7相互作用的M2-PK的构象、亚型、形成MHC I类胞内抗原复合物的情况，进而刺激细胞毒性T细胞活化，并在临床样本中进行验证。明确发挥作用的关键分子间的相互作用，努力寻找可以方便人工干预的增强机体抗病毒免疫作用的靶标分子，深入认识温热诱导抗病毒免疫机制。

本项目紧密围绕受温热影响显著高表达的DNAJA4分子，构建了特异基因缺陷细胞系以及组织特异性基因缺陷动物。在分子相互作用方面完成大量工作①研究小组首先基于CRISPR/Cas9技术构建了DNAJA4基因缺陷HaCaT细胞系，同时构建了基于Cre-Loxp技术的组织特异性基因工程小鼠，共同实现了在表皮细胞中特异性敲除DNAJA4基因的小鼠。②在HaCaT细胞系中，使用免疫共沉淀技术（IP），使用DNAJA4抗体，pull down相互结合的蛋白，重复进行质谱检测，得到有价值的目标蛋白。③项目组使用DNAJA4-KO细胞系，研究了DNAJA4对HaCaT细胞中的的大分子及其乙酰化的影响。基于PCR阵列研究了DNAJA4对miRNA的影响。④项目组反复研究了可能受温热和DNAJA4影响的M2-PK的mRNA表达、总蛋白表达、细胞定位、蛋白磷酸化、蛋白构象变化，然而该现象未能得到重复，比较确凿的否定了M2-PK的作用。⑤ 44℃温热刺激与DNAJA4基因缺失均可造成P65蛋白质的磷酸化，并促进下游基因转录，且该活化反应可被特异性抑制剂PDTC和Helenalin所阻断。DNAJA4基因缺失降低了HaCaT细胞对44℃温热刺激的抵抗力，造成细胞死亡增加，S期比例下降，MTS增殖放缓，而这些效应可被PDTC部分阻断。⑥研究发现44℃温热刺激可上调人类正常角质形成细胞及HPV 感染CA 组织中DNAJA4、CLU 及p-ERK 的表达水平。上调的CLU 及p-ERK 分别通过抑制细胞凋亡、维持细胞周期发挥细胞保护作用。DNAJA4、CLU 及p-ERK 之间存在相互调控关系，可能为细胞在应激状态下的反馈调节机制。⑦研究发现DnaJA4与细胞骨架蛋白——微管蛋白、 肌动蛋白发生相互作用。阐释了DnaJA4在温热过程对HaCaT细胞F-actin 的影响，该影响可能有助于HPV病毒抗原处理与呈递。温热联合DNAJA4敲除还广泛影响细胞的增殖与凋亡，这些改变均可能成为温热治疗临床效应的机制之一。再者，温热联合DNAJA4敲除对感染性疾病通路，尤其是病毒感染、抗原提成等相关通路有着一定的影响，更加提示我们温热治疗HPV感染有效性的免疫学机制。这些重要数据对我们未来研究重点有着重要提示意义。