HSPA2在HBV感染诱导抗凋亡与免疫逃逸中的作用及机制研究

Based on the important scientific enlightenment of literature and the research of our group, infection and hypoxia, etc, can cause overexpression of HSPs which may shift at the cellsurface or be released into extracellular milieu during cell necrosis. This topic intends to study the relationship between HBV infection and HSPA2 in antiapoptotic effects and HBV immune evasion, and the potential mechanism. Further to research the role of HBV, PreS，HBx and its mutant on TLR2/TLR4/TLR9 expression and signal pathways. We test the mutual adjustment relationship between HBV, HBx,PreS and HSPA2,and the interaction of protein molecules related using them with protein Western blot, immunoprecipitation, precipitation, gel migration retardation assays, confocal laser. And design the siRNA or antagonists against TLR2/TLR4/TLR to observe the impact of IRAK4, of TRAF6, NF-kB activation and apoptosis and immune response and uncover how HBx regulated antiapoptosis and immune funtion and mechanism through TLR2/TLR4/TLR9 pathway.

基于文献报道及前期研究结果的重要科学启示，推测HBV的多种蛋白可通过TLR2/4/TLR9通路调控HSPA2的表达，HSPA2过表达作为感染微环境，参与感染细胞抗凋亡和免疫逃逸。然而其详细机制尚不清楚。基于此，本课题设计拟从HSPA2在HBV诱导其感染细胞抗凋亡与免疫逃逸这一关键科学问题出发，以HBV、preS、HBx与HSPA2通过TLR2/TLR4/TLR9通路为切入点研究其作用，并揭示其机制。拟通过体内外实验，结合临床研究HBV、preS与HBx对TLRs表达及其信号通路的作用；采用western blot、凝胶迁徙阻滞实验、激光共聚焦技术、荧光素酶报道基因系统等研究HBV多种蛋白对HSPA2表达的影响；进一步探讨HSPA2作为内源性配体通过TLR2/TLR4/TLR9途径在HBV诱导抗凋亡与促进免疫逃逸中的作用及其机制，为以HSPA2为靶点的干预新策略提供理论基础。

HBV感染引起肝细胞内外环境发生改变，如细胞因子、应激分子等表达的变化参与炎症乃至肿瘤的发生与发展。基于文献报道及前期研究结果的启示，推测HBV的多种蛋白可通过通路调控热休克蛋白家族成员的表达，参与感染细胞抗凋亡和免疫逃逸，然而其详细机制尚不清楚。本课题通过体内外实验，结合临床病理标本，探讨了应激蛋白家族成员HSPA2/HSPA5（GRP78）作为内源性模式分子在肝癌表达及其意义，与肿瘤发生关系及其机制，研究证明：①在肝癌组织中HSPA2、HSPA5的表达高于癌旁组织，HSPA5在HBV阳性肝癌组织中表达高于阴性组，PTEN在癌旁组织的表达高于癌组织，且其表达随分化程度的降低而降低，提示PTEN的低表达可能与肿瘤细胞恶性变有关。PTEN在HBV阳性组低于HBV阴性组，说明在HBV感染中抑癌基因PTEN表达下调可能与肝癌发生发展有关。HBV感染的肝细胞内HBs、HBpres和HBx的表达均可下调PTEN的表达。TLR2/3在原发性肝癌中的表达高于癌旁组织以及血管瘤组织，HBV阳性肝癌组织高于HBV阴性肝癌组织，可能与其感染诱导靶细胞细胞因子的分泌及其应激分子的表达相关；②进一步研究证明HBV感染诱导microRNAs的表达调控HSPA2/5和PTEN的表达与肝癌的发生有关；③HBV可诱导炎性因子IP-10、IL-23、IL-32的表达通过调控HNF4a、G6Pase、HSPA2/5、Bcl-2以及CD133、MMP9表达促进HBV感染细胞恶性化特征；④HSPA家族HSPA5（GRP78）可诱导耐受性树突状细胞，进而诱导Treg细胞和抑制效应T细胞的增殖，提示可能在肿瘤微环境免疫逃逸以及抑制炎症反应中起重要作用。进一步研究证明HSPA5（GRP78）通过CD14依赖的方式诱导一种非炎症性的TLR4的内吞，从而抑制了TLR4激动剂LPS诱发的炎症反应。CD14作为TLR4的共受体，在TLR4介导的炎症过程中发挥双重作用，即LPS诱导的促炎作用和GRP78诱导的抑炎作用。上述研究结果提示HSPAs家族作为内源性模式分子与固有免疫细胞模式受体（如TLRs）结合在HBV感染炎症形成、免疫耐受以及肿瘤免疫逃逸中发挥复杂网络作用。通过课题研究为以HSPA2/5和PTEN为靶点的调控干预HBV感染相关疾病的治疗提供了新策略。