重组Amelogenin和EMPs诱导骨髓基质细胞成骨分化及其调控机制的比较研究

以骨髓基质细胞为种子细胞，釉基质蛋白(EMPs)为分子信号，通过组织工程学手段，有望获得理想的牙周组织再生。但EMPs的异源性以及成分复杂难于调控等问题限制了其在牙周组织工程中的应用研究。而釉原蛋白（Amelogenin）是EMPs的主要成分。研究表明Amelogenin具有诱导牙周组织再生的能力。我们的前期研究结果提示，在Amelogenin作用下，骨髓基质细胞的一些信号分子及成骨相关分子表达水平发生变化。因而我们推测Amelogenin可能可以代替EMPs，用于体外诱导骨髓基质细胞的分化，实现可调控的牙周组织再生。 本课题拟通过比较重组 Amelogenin和EMPs诱导骨髓基质细胞成骨分化的作用及其调控机制，揭示BMSCs在重组Amelogenin作用下的分子调控机制，为利用重组Amelogenin获得可调控的牙周组织工程再生的应用研究奠定基础。

背景：通过组织工程学手段，釉基质蛋白(EMPs)作用于骨髓基质细胞（BMSCs），可望获得理想的牙周组织再生。而釉原蛋白（Amelogenin，Am）是EMPs的主要成分。研究表明重组人Am （rhAm）具有诱导牙周再生的能力。目的：本课题比较研究rhAm和猪EMPs诱导人BMSCs成骨分化的作用及其调控机制。.方法：选择BL21/pET28a-His-SUMO-rhAm表达系统，经诱导表达和酶切纯化得到25KDa全长rhAm；乙酸法提纯猪EMPs。体外培养人BMSCs，采用MTT测定细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期。采用RT-PCR及Western blot方法检测rhAm和猪EMPs作用BMSCs后成骨因子（Runx2、OCN、ALP、COL-I）和及NF-κB信号通路分子相关因子（P65、P52、Fra-1）的变化，观察时效关系；利用阻断剂/激活剂,调控细胞信号分子后，检测rhAm和猪EMPs作用人BMSCs后NF-κB信号通路分子和成骨因子的表达，并观察时效关系。同时采用碱性磷酸酶和茜素红染色检测蛋白对人BMSCs成骨矿化作用的影响。.结果：乙酸法成功提取了猪EMPs，经鉴定符合Amelogenin占优势的猪釉基质蛋白的典型特征；成功体外合成重组人釉原蛋白， Western blot证实为25kDa全长rhAm。MTT法和BrdU掺入法均表明，EMPs和rhAm能显著增加BMSCs的DNA合成，其中200μg/ml的EMPs与10μg/ml的rhAm作用效果之间无显著性差异。RT-PCR、Western blot及细胞染色的结果提示rhAm和EMPs均可明显促进BMSCs中成骨相关因子的基因及蛋白表达，且与作用时间相关。而NF-κB信号通路在蛋白作用早期时受到激活，随着作用时间的延长逐渐受到抑制。加入抑制剂后rhAm及EMPs促进成骨的作用及NF-κB信号通路相关因子的表达均受到抑制。.结论：本研究从基因、蛋白、细胞三个水平上证实了EMPs与rhAm均能明显促进人BMSCs的成骨向分化。并发现两种蛋白可能是通过对NF-kb（P52、P65）及其下游（Fra-1）相关通路的调节作用从而促进成骨。初步探索了BMSCs在rhAm作用下的分子调控机制，也为rhAm今后的临床应用提供了一定的理论依据。