软骨终板干细胞通过BMP-2介导的Smad依赖性信号通路调节髓核细胞增殖

Disc degeneration is related with the death of nuclues pulposus cells (NPCs) caused by stress and nutritional change. Recent studies has proven that cartilage endplate degeneration may be initiating factor of nucleus pulposus degeneration. Calificed cartilage endplate lead to decreased nutritional exchange and further nucleus pulposus degeneration.To our knowledge, the molecular mechanism for early nucleus pulposus degeneration caused by cartilage endplate has not been clarified. In our previous work, we conclusively indicated the presence of progenitor cells in degenerated cartilage endplate, and gave those cells the name as CESCs. Bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) and signalling molecules related to Smad dependent signal pathway such as Smad 1/5/8 and receptors of BMP-2 were respectively found in CESCs and NPCs. Therefore, we make the hypothesis that BMP-2 is a regulating factor of NPCs proliferation. CESCs regulate NPCs proliferation and play a role in disc degeneration via paracrine BMP-2 and Smad dependent signal pathway.In this study, we shall set up coculture system of CESCs and NPCs, and make use of BMP-2siRNA and recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene.The expression of signalling molecule of Smad dependent pathway mediated by BMP-2 will be observed. The purpose of this study is to confirm that CESCs regulate NPCs proliferation by means of BMP-2 mediated Smad dependent signal pathway, and to provide a novel rationale for disc degeneration therapy.

软骨终板退变可能是髓核退变的始动因素，软骨终板钙化使营养交换减少，造成髓核进一步退变，但是有关软骨终板导致髓核早期退变的机制不清。本课题组在前期研究中发现人退变软骨终板中存在干细胞并命名为CESCs，并在该细胞和NPCs中证实存在骨形成蛋白-2（BMP-2）及Smad依赖性信号通路相关分子（Smad1/5/8）。为此，我们假设BMP-2是NPCs增殖的调节因子，CESCs以旁分泌BMP-2方式，通过Smad依赖性信号通路，调控NPCs增殖，影响椎间盘退变。本研究建立CESCs和NPCs共培养体系，采用BMP-2基因沉默和腺病毒转染方法，BMP-2腺病毒载体保护退变椎间盘动物实验，观测BMP-2介导Smad依赖性通路信号分子表达，探讨CESCs对NPCs增殖的调节作用。本研究将证实CESCs通过BMP-2介导的Smad依赖性信号通路调控NPCs增殖，为椎间盘退变治疗提供新的思路。

干细胞移植治疗是恢复椎间盘生物学功能最理想的方式之一。随着椎间盘内不同部位的干细胞相继发现，并且证实其在椎间盘的自我修复过程中可能发挥了潜在的作用。但目前关于内源性干细胞迁移、干细胞-髓核细胞相互作用及修复机制尚不清楚，这也限制了椎间盘内源性干细胞修的应用研究。本研究通过分离培养人原代CESCs和NPCs，研究CESCs对NPCs增殖及合成与分解代谢的影响和机制、研究NPCs对CESCs迁移的影响及机制；构建兔椎间盘退变模型研究退变髓核对椎间盘源性干细胞增殖及迁徙的影响和机制。. 本研究发现，NPCs中BMP-2基因的表达水平与其增殖速度有一定的相关性，但rhBMP-2对NPCs增殖并无显著促进作用。SDF-1和CXCR4基因在CESCs和NPCs中呈互补表达模式，即CESCs中SDF-1表达水平高于NPCs，而NPCs的CXCR4表达水平高于CESCs。一方面，细胞实验表明，rhSDF-1能显著促进NPCs增殖，CESCs可能部分通过SDF-1/CXCR4激活ERK1/2通路促进NPCs增殖。另一方面，CESCs能上调NPCs中TIMP1基因的表达，但不依赖于SDF-1/CXCR4信号轴，可能通过抑制多种MMPs的活性参与细胞外基质的代谢调节。研究发现，在兔椎间盘退变早期椎间盘干细胞巢干细胞（ISN-SCs）分裂增殖并向椎间盘内迁徙，但在退变晚期，ISN-SCs增殖和向椎间盘内迁徙不明显。在兔椎间盘退变过程中多种趋化因子表达上调，其中CC类趋化因子配体5（CCL5）表达上调最明显。进一步研究发现，CCL5在退变NPCs促进ISN-SCs迁移过程中发挥重要作用。NPCs能上调CESCs 中β1整合素蛋白(ITGB1)和整合素配体层粘连蛋白α4亚基（LAMA4）基因的表达，进一步研究证实ITGB1在NPCs促进CESCs迁移过程中发挥重要作用。. 本研究结果进一步明确了CESCs与NPCs的相互作用及机制，并且对椎间盘内源性干细胞在椎间盘退变过程中的增殖和迁徙有了初步了解，能为椎间盘内源性干细胞修复的应用研究奠定基础，为椎间盘退变治疗提供新的思路。