基于液质联用技术与血小板活化通路探讨爵床抗血小板聚集的活性成分及其作用机理

Cardiovascular and cerebrovascular disease is one of the major diseases that cause serious damage to human health with high recurrence, high disability rate and high mortality. As an important means of prevention, anti-platelet aggregation therapy still lacks safe and effective clinical drugs, so conducting research on anti-platelet activation drugs has become a hot issue in the field of biological science. Justicia, a folk herb, which is widely distributed in the south of Qinling and southwest poor mountainous districts in China, is rich in resources. Previous studies from the applicant have shown that Justicia has a good anti-platelet aggregation effect, but its material basis and mechanism remain unclear. Given these, this study intends, firstly, to screen and identify the anti-platelet aggregation chemical composition from Justicia by using platelets as the target and then adopting LC-MS technology to screen the anti-platelet aggregationl activities of compounds from the active site, secondly, to ascertain the anti-platelet aggregation signal pathways by co-incubation of active compounds and the separated total proteins from platelet exploiting natural gel electrophoresis technology, combined with LC-MS spectrometry to determine the corresponding target protein. Our research aims at elucidating the material foundation of efficacy of Justicia to make it possible to work out a neotype drug with anti-platelet aggregation activity, as well, providing a reference way for the exploitation of medicinal plants resources in impoverished mountainous areas.

心脑血管系统疾病为严重危害人类健康的重大疾病，具有高复发率、高致残率、高死亡率的特点。抗血小板治疗是心脑血管系统疾病重要的防治手段，目前尚缺少安全有效的临床药物，抗血小板活化药物的研究已成为生物科学领域的热点问题。爵床为民间草药，广泛分布于我国秦岭以南和西南贫困山区，资源丰富。项目申请人前期研究表明，爵床具有良好的抗血小板聚集作用，但其物质基础和作用机理尚不明确。本项目拟在前期研究的基础上，以血小板为靶标，采用液质联用技术对爵床抗血小板聚集活性物质部位进行分离鉴定和活性筛选，确定活性成分；采用自然胶电泳技术，对血小板全蛋白进行分离；通过自然胶使蛋白质与活性成分共孵育，结合液质联用技术分析活性成分的靶蛋白，确定抗血小板聚集作用信号通路，以期诠释爵床的药效物质基础，为将其开发为抗血小板聚集的药物提供依据，并为贫困山区开发药用植物资源探索途径。

心脑血管系统疾病为严重危害人类健康的重大疾病，抗血小板治疗是心脑血管系统疾病重要的防治手段，目前尚缺少安全有效的临床药物，抗血小板活化药物的研究已成为生物科学领域的热点问题。爵床为民间草药，广泛分布于我国贫困山区，资源丰富。项目负责人前期研究表明，爵床具有良好的抗血小板聚集作用，但其物质基础和作用机理尚不明确。.本项目在前期研究的基础上，完善了爵床抗血小板聚集活性测定模型，确定活性部位为乙酸乙酯萃取部位。对活性部位的化学成分进行了分离纯化，得到部分单体化合物；完善了血小板富集活性成分模型，确定可能的活性成分；以抑制兔血小板聚集的最大抑制率、抑制人血小板聚集的IC50值以及大鼠入血成分为指标，筛选活性成分为6′-羟基爵床脂定B、新爵床脂定A、爵床脂定B、金不换甲醚、新爵床脂定B等木脂素类化合物。采用自然胶电泳技术，使血小板蛋白与活性成分共孵育，得到靶蛋白胶条，液质联用技术分析胶条寻找靶蛋白，并通过Western Blot试验验证靶蛋白；进一步采用基因芯片技术，通过高通量信息分析，显示乙酸乙酯萃取部位能同时抑制Gq-PLC-PKC和Gi-PI3K-MAPKs两条信号通路，活性成分新爵床脂定 A可能直接作用于靶蛋白整合素αⅡbβ3；采用微量热泳动技术以及分子对接软件考察活性成分与靶蛋白结合情况，进一步确定整合素αⅡbβ3为靶蛋白。采用DNA条形码鉴定技术，鉴别野外同区域不同生长形态的爵床植株为同种植物；采用高效液相色谱法，测定不同生长形态爵床的地上部分及其花穗、叶、茎中爵床酯定B和金不换甲醚的含量，并比较含量差异。结果表明，不同生长形态的爵床植株中爵床酯定B含量无差异，金不换甲醚的含量存在显著性差异；同时，爵床茎中有效成分的含量极少，故采收期以花穗和叶多的花、果期为佳。研究结果为贫困山区药用植物资源开发利用提供依据。.研究成果发表论文11篇，其中SCI 论文8篇；申请发明专利1项；培养博士生1名，硕士生3名。