裸花紫珠抗血栓活性成分分离及其抗ADP诱导血小板聚集活性和作用机制研究

Thrombus is a common and frequent disease, which endangers human health severely. Potential adverse effect and resistance of antithrombotic drugs make R&D of natural products significant. In our prophase research, we found 80% ethanol extraction of Callicarpa nudiflora Hook. et Arn. could inhibit ADP-induced platelet aggregation. Then we isolated 30 compounds form 2 compositions of the extraction, among which 7 were new. 5 components (2 triterpenes and 3 flavonoids) show excellent inhibitory activity on ADP-induced platelet aggregation. The tests indicate that some unknown triterpenes (triterpene glycosides) and flavonoids also have high activity. But the active ingredients, the mechanism or structure-activity relationship are still unclear. To deal with the above issues, our three-step object is as follows: (1) Antithrombotic components (triterpenes and flavonoid) isolation and identification; (2) Antithrombotic activity evaluation and screen; (3) Mechanism and structure-activity relationship investigation. Our study will clarify the antithrombotic substance in Callicarpa nudiflora Hook．et Arn, reveal the active ingredients and their mechanism and structure-activity relationship. Finally, we can provide scientific basis for development of novel antithrombotic TCM possessing independent intellectual property and for pursuit of antithrombotic lead compounds.

血栓病是一类严重危害人类健康的常见病和多发病。许多抗血栓药物具有潜在的不良反应或抗药性，因此天然抗血栓药物的研发具有重要意义。在前期研究中，从具有抑制ADP诱导血小板聚集活性的裸花紫珠80%乙醇提取物其中2个组份中得到了30个化合物，其中新化合物7个。5个化合物（3个三萜类和2个黄酮类）显示良好的抑制ADP诱导血小板聚集活性。试验表明还存在其它高活性组分，活性组分中还存在三萜（苷）类和黄酮类，但其中的活性成分是什么？其作用机理如何？构效关系如何？目前尚不清楚。为此，本课题拟开展：（1）抗血栓活性成分（三萜类和黄酮类）的分离与鉴定；（2）活性成分抗血栓活性评价与筛选；（3）抗血栓活性成分作用机理及构效关系研究。通过本课题的研究阐明裸花紫珠抗血栓药效物质、抗血栓活性成分及其作用机理和构效关系，最终从构效关系角度为研发具有自主知识产权的抗血栓中药创新药物、寻找抗血栓先导化合物提供科学依据。

对裸花紫珠粗提物进行了止血活性筛选及其作用机理研究，首次发现裸花紫珠醇提物粗分后乙酸乙酯和正丁醇部位均具有缩短BT和CT，降低APTT，并增加血小板数量并刺激血小板活化，显示止血作用；首次阐明了裸花紫珠乙酸乙酯和正丁醇部位的止血活性作用机理是通过影响血小板的Akt、P38MAPK和Erk信号通道活性实现。.从裸花紫珠醇提取物中分离鉴定了76个化合物，其中新化合物18个，25个化合物为首次从裸花紫珠中分离得到。在多种ADP诱导的血小板体外凝血活性模型、保肝护模型、抗糖尿病模型PTP1B和α-葡萄糖苷酶、肿瘤细胞模型上对裸花紫珠的部分单体化合物进行了活性筛选，发现5个化合物可以显著抑制ADP诱导的血小板聚集，具有抗凝血活性；1个化合物可增强ADP诱导的血小板聚集，具有止血活性。 .首次从裸花紫珠中发现具有抗ADP诱导血小板聚集活性的化合物7个和具有抗花生四烯酸诱导血小板聚集活性的化合物8个，进一步活性评价发现化合物32和38可降低花生四烯酸诱导的血小板聚集率和血小板中P-选择素、TXA2的含量，显示较强抗花生四烯酸诱导血小板聚集活性，IC50值分别为0.129和0.0413 mmol/L（阳性药奥扎格雷终浓度为0.2mmol/L时，抑制率为43.80%）。首次阐明了化合物32和38体外抑制血小板聚集作用机理是通过抑制血小板PI3K/AKT信号通路，32同时具有抑制PLC/PKC信号通路的作用，从而抑制蛋白RhoA、PKA的表达，降低血小板聚集率、TXA2的生成和P-选择素的释放，贯穿血小板形变、聚集、释放等多个反应。.首次从裸花紫珠中发现14和24两个化合物对MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞的体外侵袭和迁移能力具有明显地抑制作用，进一步体外抗转移药效研究发现，化合物14和24对高转移乳腺癌细胞的体外迁移、侵袭和粘附能力均有显著抑制作用。进一步的研究表明，化合物14和24可通过抑制细胞骨架蛋白F-Actin的聚合而下调肿瘤细胞的体外运动能力。.首次采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法建立了大鼠血浆中木犀草苷、 Dracocephaloside、Juncein、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、Nudifloside等七个活性成分同时定量的分析方法。