海洋放线菌非核糖体肽类天然产物的挖掘及其生物合成途径中肽骨架修饰蛋白的功能研究

The nonribosomal peptide natural products produced from marine actinomycetes are important sources of bioactive molecules. Two of these nonribosomal peptides, salinosporamide A and thiocoraline, have been in the FDA phase-I and preclinical development for anticancer drugs, respectively. However, only a few marine actinomycetes-produced nonribosomal peptides have been discovered, and little biosynthetic research has been done for these natural products. In this study, we plan to (1) discover more nonribosomal peptides from marine (mainly the south China sea) actinomycetes using PCR-based genome mining and MS-based chemical investigation; and (2) carry out the biosynthetic research for these natural products, especially characterizing the functions of peptide skeleton-modifying proteins, which contribute a lot to the chemical complexity and bioactivity. These studies will contribute to the discovery and biosynthetic research of marine actinomycetes-produced nonribosomal peptides, and to our country's novel clinical drug discovery and marine sources exploitation.

海洋放线菌中的非核糖体肽类天然产物是药用功能分子的重要来源，现在已有salinosporamide A和thiocoraline分别进入FDA抗癌一期临床研究和临床前评价。然而，当前对海洋放线菌非核糖体肽类天然产物的探索发现还有巨大的潜力可挖，对此类天然产物的生物合成研究更是较少开展。本课题拟通过基于PCR筛选的基因组挖掘技术和对小规模发酵提取物的质谱（MS）等化学筛查技术，对海洋（主要是我国南海海域）放线菌中的非核糖体肽类天然产物进行探索发现。在此基础上开展其生物合成研究，重点对其生物合成途径中、对化合物结构复杂性和生物活性重要的肽骨架修饰蛋白的催化功能进行研究。通过本课题的研究，将弥补国内外对海洋放线菌非核糖体肽类天然产物相关研究的不足，为我国开发具临床药用价值的创新药物及推动我国海洋资源的开发利用做出贡献。

近年来，海洋来源的放线菌吸引了越来越多的注意，尤其是海洋放线菌所产非核糖体肽类化合物具有结构多样性和重要生物活性。然而，相对于陆地放线菌中已经发现的成百上千种非核糖体肽类天然产物，海洋放线菌中非核糖体肽天然产物的探索发现还远远未达到相应的广度和深度。非核糖体肽生物合成中的骨架修饰反应是结构多样性的重要来源并对生物活性至关重要。目前对海洋放线菌来源非核糖体肽生物合成途径中骨架修饰蛋白的功能研究开展较少。.本项目按照申请书和资助计划书中的研究计划顺利进行了实施，在构建海洋放线菌菌种库及产非核糖体肽类阳性菌株的筛选方面，项目构建了超过1500株的海洋放线菌菌种库，筛选得到了一系列阳性非核糖体肽菌株；在非核糖体肽类化合物的分离和生物合成基因簇的测序方面，发现了pepticinnamin, skyllamycin, WS9326A, bacillibactin, bacillomycin, brasiliamide等六类以上的新颖非核糖体肽类，发现部分化合物具有抗肿瘤和抗菌活性。在骨架修饰蛋白编码基因的敲除以及突变体表型的化学分析方面，测定了所有这些化合物的生物合成基因簇，敲除了pepticinnamin类化合物中负责非蛋白氨基酸2-氯-3-羟基-4-甲氧基苯丙氨酸合成的卤代酶、甲基转移酶、羟化酶等编码基因，首次阐明了非蛋白氨基酸2-氯-3-羟基-4甲氧基苯丙氨酸的生物合成机制；敲除了brasiliamide中负责羟基化、乙酰化、开环裂解修饰的P450、酰基转移酶、α-KG依赖氧化酶的编码基因，对所有敲除突变体进行了化学表型分析，得到了生物合成中间体，确定了这些基因的功能，首次发现一个α-KG依赖氧化酶催化哌嗪环开环裂解反应；在骨架修饰蛋白的体外酶活表征和晶体结构研究方面，表征了pepticinnamin生物合成中的甲基转移酶、brasiliamide生物合成中的α-KG依赖氧化酶等体外催化活性，解析了1个P450蛋白晶体结构和1个II型肽基载体蛋白的晶体结构。以上研究结果在充分利用我国海洋菌株资源及其药用资源构建、非核糖体肽骨架修饰机制前沿研究方面具有特殊意义。项目圆满完成年度计划的执行，截至目前已经发表通讯作者论文10篇，包括7篇SCI论文，超出项目预期的科研成果。