非核糖体肽类天然产物生物合成中催化四种反应类型的硫酯酶催化机制和晶体结构研究

The nonribosomal peptides are important source of clinically used drugs. The thioesterases in the biosynthesis of noribosomal peptides catalyze four types of reactions including hydrolysis, cyclization, oligomerization-cyclization and carbon-carbon cyclization, determining the chmical skeletons of nonribosomal peptides. Although there have been plenty of nonribosomal peptides discovered and the modular nonribosomal peptide synthetases (NRPS) have been extensively studied, the catalytic mechanisms and structural biology of thioesterases in nonribosomal peptides biosynthesis are far away from being fully characterized. In this study, we plan to reconstitute the enzymatic reactions of thioesterases in vitro based on solid-phase peptide synthesis (SPPS) and solve the crystal sructures of thioesterase or thioesterase-substrate mimic complex. The thioesterases we studied will include ones in the biosynthesis of new nonribosomal peptides discovered from our bacteria library of special environment origin (marine or plateau), and ones in the biosynthesis of known representative nonribosomal peptides. These work aim to uncover the structural basis determining the reactions of hydrolysis, cyclization, oligomerization-cyclization and carbon-carbon cyclization catalyzed by thioesterases, and characterize the molecular mechanisms of substrate selectivity, substrate promiscuity and detailed catalysis of thioesterases. These results will contribute to the deep understanding of the biosynthesis of nonrobosomal peptides, and facilitate the enzymatic engineering and chemoenzymatic catalysis for the development of new nonribosomal peptide lead drugs.

非核糖体肽类天然产物是临床药物的重要来源，其生物合成中的硫酯酶可以催化水解、环化、聚合环化、碳-碳键连接环化四类反应，决定了非核糖体肽化学结构的骨架类型。尽管当前对非核糖体肽及其生物合成中模块化的非核糖体肽合成酶已经有了相当的研究，然而对生物合成中硫酯酶的四种不同催化机制和三维结构等研究则较为滞后。本项目拟对本课题组发现的特殊生境（海洋、高原）细菌来源的新颖非核糖体肽以及已知的代表性非核糖体肽，选取它们生物合成中催化上述反应的多种硫酯酶，一方面运用固相有机方法合成底物类似物,对它们的体外酶催化反应进行表征,另一方面开展硫酯酶或硫酯酶-底物复合物晶体结构的研究，以揭示决定硫酯酶催化上述四类反应的结构基础。本课题研究将推进非核糖体肽生物合成中硫酯酶的基础研究，并为基于硫酯酶工程改造和化学-酶联反应开发新颖非核糖体肽药用先导物提供依据。

非核糖体肽合成酶（NRPS）中的硫酯酶功能域负责形成肽骨架分子，其催化的水解、环化等的反应机制、底物选择性和杂泛性机制目前研究仍然较欠缺。因此，阐明硫酯酶的催化功能和催化机制，对于理解非核糖体肽的形成以及利用硫酯酶开展化学-酶联反应具有重要意义。.本项目主要研究内容包括了从发现到生物合成的系统研究：采集海洋生物样品（海绵，珊瑚，海泥等）并分离其内生细菌，建立北京大学海洋细菌菌种库；从菌种库中发现非核糖体肽化合物，并确定它们的生物合成基因簇及其中的硫酯酶；通过硫酯酶的表达纯化，使用固相有机合成的底物类似物开展体外催化表征；通过晶体结构或者预测建模等方法揭示硫酯酶催化反应机制；最后利用硫酯酶的底物杂泛性催化不同的化学合成底物类似物产生新颖非核糖体肽分子。.项目按照研究目标对 skyllamycin, WS9326A, PTM，耶尔森菌素等的硫酯酶开展了研究。通过晶体结构研究和定点突变实验，发现它们的整体结构都比较相似，均为α/β水解酶的折叠类型，但是决定它们底物识别和反应类型的是活性位点的环境和残基种类。另外，覆盖在活性位点的“盖子区”参与环化反应中与底物的动力学相互作用。这些发现的现象和规律加深了对硫酯酶产生非核糖体肽骨架结构多样性的理解。尤其是对skyllamycin生物合成中硫酯酶的研究，我们发现并表征了环肽分子生物合成中第一个催化异构化和环化的双功能硫酯酶，扩展了对非核糖体肽合成酶NRPS功能域“多才多艺”的认识；并利用该硫酯酶开展了化学-酶联催化，制备了系列构型控制的新颖环肽分子。.项目目前已经发表论文15篇，包括SCI论文12篇，包括Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catalysis、Chemical Science、Acta Pharm. Sin. B.、ACS Chemical Biology等，远超出预期成果中3-5篇论文的目标。相关专利正在申请中。在人才培养方面，本项目也取得丰硕成果，在四年间共资助培养了4名博士后出站、5名博士生毕业、3名硕士生毕业，也超出原有的预期目标。