基于PPTase对聚酮和聚肽合成酶修饰活化挖掘放线菌天然产物

Polyketides and polypeptides in natural products (NPs) are the important source of new drugs. The new NPs discovering rate becomes more declined based on the traditional mining method with bioactivity screen, which has sharpened the confliction between the pace of new drug development and the drug-resistant disease. Recent years, the genome sequencing and analysis indicate that 90% NPs in microorganisms are “cryptic” or “silent” under standard laboratory growth conditions, and the tremendous biosynthesis capacity of natural products is yet to be mined. Therefore, it is of great significant to develop a highly efficient and highly universal method for activating the “cryptic” NPs. Currently the mining methods mainly focus on the regulation of biosynthesis genes and protein translation, while we develop a new method from a new view of post-translational modification of polyketide and polypeptide synthases, activating NPs via modifying the synthases. At present, we have successfully activated various NPs from 12 different actinomycetes using the method (efficient ratio 60%). We will investigate its universality and efficiency by expanding the sample size, and further validate the working mechanism and optimized method with in in vivo and in vitro experiments. Meanwhile, large quantities of NPs will also be uncovered. Successful implementation of the project will provide new suggestions for NPs mining, and the developed approach will greatly accelerate new drug research of microorganisms.

聚酮和聚肽类天然产物是新药的重要源泉。基于活性筛选的传统挖掘方法发现新化合物的频率已愈来愈低，使新药研发速度和耐药疾病的矛盾愈发严峻。基因组学研究发现微生物中约90%的天然产物在常规条件下处于沉默，其巨大的合成潜力尚未发掘。因此，发展高效、高普适性的激活沉默天然产物的方法具有重大意义。当前天然产物的挖掘主要集中在生物合成基因调控和蛋白翻译过程，我们从聚酮和聚肽合成酶熟化过程这一新的角度出发，发展了利用PPTase基因活化聚酮聚肽合成酶,激活天然产物的新方法。前期利用该思路从12株放线菌中成功激活出了多种天然产物（有效率60%）。本项目中，我们将进一步扩大样本容量，系统考察该方法的普适性和有效性。通过体内，体外实验验证新方法的工作机制及优化方法。此外，通过新方法还将挖掘出大量新结构活性天然产物。本项目的成功实施，将对天然产物的挖掘提供新的思路，所发展的方法对微生物新药研究具有重要的促进作用。

微生物天然产物是新药发现和发展的重要源泉。然而由于长期缺乏新的研究方法和研究思路，新结构的活性天然产物发现率愈来愈低。本项目发展了一种通过增强聚酮和非核糖体多肽生物合成中载体蛋白的活化激活微生物“沉默”生物合成途径的方法。我们将sfp和svp两个底物宽泛的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（phosphopantetheinyl transferase，PPTase）基因转移至34株放线菌中过表达，然后通过发酵及次级代谢产物分析，发现其中24株重组菌次级代谢产物发生了明显改变，新产生化合物或已知化合物产量得到很大提高，有效率高达71%。此结果说明了该方法具有较广的普适性，而且不需要提前预知微生物的基因组序列信息。.为了阐明该方法的作用机制，对三株有效重组菌株新产生化合物进行分离纯化，并分离得到8个化合物，其中4个为新化合物oviedomycin B 和 C，puromycin B 和 C，并且具有一定的抗肿瘤活性。接着以基因组测序的链霉菌S. antibioticus NRRL 3238为案例，通过体内基因中断、体外生化表征以及转录水平分析以阐明了其作用机制。首先对其基因组进行生物信息学分析，获得了oviedomycins生物合成基因簇（ovm）和内源PPTase基因序列，并通过基因中断和突变菌株发酵分析，确认了ovm生物合成基因簇与化合物oviedomycins的相关性。然后将PPTase异源表达和载体蛋白ovmS的催化活性测试，发现内源PPTase尤其位于该生物合成基因簇中的PPTase (P1)活性与外源的PPTase相当，并且通过体内过表达P1也产生oviedomycins，说明ovm生物合成基因簇的沉默不是由于内源PPTase活性所致。然后对ovm生物合成基因、内源PPTase基因、sfp和svp进行了转录水平分析，发现野生型和重组型菌株ovm生物合成基因和内源PPTase基因表达水平相当，但是内源PPTase基因远低于载体蛋白ovmS基因的表达量，而sfp和svp的转录水平与其相当，说明ovm生物合成基因簇的沉默是由于载体蛋白活化所需的PPTase提供不足所致，而过表达的外源PPTase能够充分活化载体蛋白，从而激活“沉默”的天然产物生物合成基因簇。这一高效、通用的新研究方法也将其他微生物资源充分挖掘天然产物合成潜力提供了新的思路，对微生物新药发现具有重大意义。